Purificação Mitocondrial (Roteiro de Prática)

Purificação Mitocondrial (Roteiro de Prática)

CEFET – QUÍMICA/ URJ

Coordenadoria de Biotecnologia

Bioquímica II

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Mitocôndria

Purificação e Inibidores

A) Material:

Geral:

  • Potter

Por grupo:

  • 1 pipeta de 1 e 5 mL.

  • 2 Pró-pipetes

  • 10 tubos de ensaio

  • Pipetador automático de 200μL e de 1mL

Soluções:

  • Hepes 2mM com Sacarose 0.28M e Albumina 0.05% (p/v) pH 7,4 (0,5 L)

(Solubilizar o Hepes e a sacarose, acertar o pH com KOH 1 mol/L, depois solubilizar a albumina e avolumar)

  • KOH 1M

  • Tampão fosfato 100mM pH 7,4

  • Azul de metileno 0,01%

  • Homogenato de figado

  • Succinato de potássio 200mM

  • Malonato de potássio 100mM

  • Azida de sódio 100mM

  • Óleo mineral ou vaselina líquida

B) Método:

I - Purificação mitocondrial

Separar a fração mitocondrial, excluindo a fração nuclear (mais pesada) e excluindo a fração microssomal e solúvel (mais leves).

Utilizar meio isotônico contendo albumina (para poteger as mitocôndrias da ação detergente de ácidos graxos)

1- Sacrificar o camundongo (usar 4 animais), fazer uma incisão abdominal e retirar o fígado.

2- Lavar o fígado 1x com 15 mL de tampão em becker.

3- Cortar com tesoura em pedaços pequenos e lavar, 2x com 15 mL de tampão.

4- Homogeneizar em duas etapas: Colocar metade da massa de fígado em um potter com 10mL de tampão e homogeneizar com 4 passos (4 idas e 4 voltas) à 400 rpm (use uma furadeira caso não haja um mixer).

5- Diluir tudo à 160mL com tampão e reservar 40 mL do diluído (para 8 grupos)= homogenato total

6- Pesar os tubos e equilibrá-los.

7- Centrifugar o homogenato em 3 tubos de 45mL ou 9 tubos de 15mL, 600xg, 4°C, 10min . (PARA TUBOS DE 45ML USAR SOMENTE TUBOS CORNING POIS ELES NÃO COLABAM NO ROTOR)

Descartar o precipitado (P1) contendo restos de tecido, núcleos, hemácias e transferir para outro tubo de centrifuga o sobrenadante (S1).

8- Pesar os tubos e equilibrá-los.

9- Centrifugar S1, 7000xg, 4°C, 10 min.

Descartar o sobrenadante (S2) contendo membranas leves e fração solúvel e

Reservar o precipitado (P2)

10- Ressuspender P2 com tampão em 3 tubos com 45mL cada ou 9 tubos com 15mL cada.

11- Pesar os tubos e equilibrá-los.

12- Centrifugar 10.000xg, 4 C, 10 min

Descartar o sobrenadante (S3)

Reservar o precipitado (P3)

13- Ressuspender P3 em 40 mL total de tampão (para 8 grupos) = fração mitocondrial

II - Experiência de redução do Azul de Metileno

1- Pipetar os tubos conforme a tabela (coluna por coluna)

2- Homogeinizar levemente (SEM INSERIR AR NOS TUBOS)

3- Colocar delicadamente uma fina camada de óleo mineral na superfície da mistura (para evitar o contato com o O2).

5- Marcar o tempo que cada tubo demora para ficar incolor, SEM MEXER NOS TUBOS.

Ensaio de redução – Homogenato

Tampão fosfato

mL

Azul de metileno

mL

Água

mL

Succinato

mL

Malonato

mL

Azida

mL

Amostra

Homogenato de fígado

mL

Bco

1.0

0.1

3.1

-

-

-

-

C

1.0

0.1

2.1

-

-

-

1.0

Suc

1.0

0.1

1.9

0.2

-

-

1.0

Mal

1.0

0.1

1.8

0.2

0.1

-

1.0

azida

1.0

0.1

1.8

0.2

-

0.1

1.0

Ensaio de redução – Fração mitocondrial

Tampão fosfato

mL

Azul de metileno

mL

Água

mL

Succinato

mL

Malonato

mL

Azida

mL

Amostra

Fração mitocondrial

mL

Bco

1.0

0.1

3.1

-

-

-

-

C

1.0

0.1

2.1

-

-

-

1.0

Suc

1.0

0.1

1.9

0.2

-

-

1.0

Mal

1.0

0.1

1.8

0.2

0.1

-

1.0

azida

1.0

0.1

1.8

0.2

-

0.1

1.0

Relatório: Deve ser feito seguindo-se o roteiro de confecção de relatórios vigente.

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