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Archives of Veterinary Science , v.13, n.1, p. 54-63, 2008 Printed in BrazilISSN 1517-784X metodoloGia para quantificaÇÃo de leucÓcitos totais em peiXe, OREOCHROMIS NILOTICUS

(Total leukocyte counts methods in fish, Oreochromis niloticus) isHiKaWa,n.m1; ranZani-paiva,m.J.t.2; lombardi,J.v.2

1 Médico veterinário – doutorando, Centro de Aqüicultura da UNESP, Jaboticabal, SP; 2 Pesquisador Científico - Instituto de Pesca de São Paulo APTA-SAA, SP.

Autor: Nilton Massuo Ishikawa Endereço: Rua Almirante Tamandaré, 255, Jd. Petrópolis, Londrina – Pr, cep 86015-600. Email: nilton_ishikawa@cargill.com resumo – O estudo da hematologia é considerado uma importante ferramenta para o processo de diagnóstico de doenças. As técnicas usadas em mamíferos são amplamente aplicadas em peixes, no entanto com algumas modificações. A presença de eritrócitos nucleados e trombócitos em peixes pode causar dificuldade na identificação das células sangüíneas, principalmente na contagem de leucócitos totais. A presente pesquisa foi realizada com o objetivo de avaliar duas metodologias (direta e indireta) de quantificação de leucócitos. Espécimes de tilápia foram divididos ao acaso em quatro grupos de 48 peixes cada. Cada grupo foi dividido em três réplicas experimentais com 16 animais por réplica em aquários de 40 L e mantidos por 10 dias. A quantificação dos leucócitos foi determinada em 6 animais por grupo nos tempos: 0, 3, 7 e 10 dias. A metodologia direta em câmara de Neubauer apresentou grande oscilação dos dados com relação à média, o oposto tendo sido observado na metodologia indireta realizada em extensões sanguíneas, que apresentou maior homogeneidade entre os grupos. Devido a este fator a metodologia indireta pode ser considerada mais confiável que a metodologia direta para quantificação de leucócitos em peixes.

Palavras-chave: Sangue, leucócitos, peixe, Oreochromis niloticus.

abstract – Haematological investigation is an important part of disease diagnosis. The techniques used for mammals are generally applicable for fishes with slight modification. The presence of nucleated erythrocytes and thrombocytes in fish may cause some confusion in the identification of blood cells, mainly in total leukocytes count. This work evaluated two different methods (direct and indirect) of leukocytes counting. Specimens of tilapia were divided randomly into four groups of 48 fish each. Each group was further randomized into three replicate experiments of 16 fish per replicate in 40 L aquarium and maintained for 10 days.

Counting of leukocytes in peripheral blood was determined in six fishes per group at the times: 0, 3, 7 and 10 days. The direct method in Neubauer chamber showed a large dispersion of data in regard to the average, the opposite was observed in indirect method determined in blood smears that showed more homogeneity among groups. Due to this factor the indirect method can be considered more accurate than the direct method for counting leukocytes in fishes.

Key words: Blood, leukocytes, fish, Oreochromis niloticus.

introduÇÃo

A aqüicultura é um dos sistemas de produção que mais cresce no mundo. Baseado em estatísticas da FAO (1999), a produção brasileira, nos últimos anos tem aumentado na proporção de 30% ao ano. Assim, a aqüicultura começa a desempenhar importante papel econômico e social no cenário nacional, consolidandose como atividade em expansão, gerando alimentos, empregos, impostos e divisas (BORGHETTI e OSTRENSKY, 1998).

A tilápia, Oreochromis niloticus, é uma das espécies mais indicadas para o cultivo intensivo principalmente em países tropicais como o Brasil, onde as temperaturas favorecem seu desempenho. Além disso, suas características zootécnicas e alta qualidade de carne fazem da tilápia um produto de grande interesse para o processamento industrial. Esta espécie vem sendo criada em boa parte do país, com exceção apenas de alguns estados da região norte (OSTRENSKY et al., 2000).

Ao mesmo tempo em que ocorre a expansão desta atividade, ocorrem também os problemas sanitários, pois com a intensificação dos meios produtivos, o transporte, a má qualidade da água, entre outros, atuam como agentes estressantes, resultando em depressão dos mecanismos de defesa orgânica e aumentando a susceptibilidade dos peixes às enfermidades, que conseqüentemente causa prejuízos na produção do pescado (SCHALCH et al., 2005).

5 Metodologias de quantificação de leucócitos totais em peixe, Oreochromis niloticus

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O estudo dos parâmetros sangüíneos em peixes tem sido freqüentemente utilizado para a detecção de alterações fisiopatológicas em diferentes condições de estresse (NUSSEY et al., 1995; RANZANI-PAIVA et al., 2005). Alterações no quadro hematológico de peixes expostos a metais pesados foram observadas em Hoplias malabaricus (OLIVEIRA-RIBEIRO et al., 2006), em Acipenser baeri (MIKRYAKOV e LAPIROVA, 1996), em Oreochromis niloticus (NUSSEY et al., 1995; ISHIKAWA, 2003), em Oreochromis aureus (ALLEN, 1994), em peixes parasitados (SILVA-SOUZA et al., 2000, MARTINS et al., 2004, RANZANI-PAIVA et al., 2005; AZEVEDO et al., 2006a), o efeito do estresse por restrição alimentar em Hoplias malabaricus (RIOS et al., 2005), de toxinas (GORDON et al., 2005; MOLINA et al., 2005) e contaminação bacteriana (RANZANI-PAIVA et al., 2004; SILVEIRA-COFFIGNY et al., 2004; MISRA et al., 2006a).

Embora existam inúmeras pesquisas dos parâmetros hematológicos em peixes, as literaturas apresentam muitas informações inconsistentes com relação a nomenclaturas, diferenciação celular, maturação e função das células sangüíneas dos peixes (HRUBEC e SMITH, 1998; TAVARES-DIAS e MORAES, 2004). YASUTAKE e WALES (1983) e RANZANI-PAIVA e SILVA-SOUZA (2004) relatam que assim como as aves, os peixes possuem eritrócitos nucleados, sendo esta particularidade em alguns casos a responsável pela dificuldade na identificação e diferenciação precisa das células.

Dentre os componentes do sangue, os leucócitos representam importante papel na imunidade não específica e os seus valores podem ser considerados como indicadores do estado de saúde dos peixes (MISRA et al., 2006b). Segundo TAVARES-DIAS e MORAES (2004), as metodologias de quantificação dos leucócitos em peixes, ao contrário das dos mamíferos, apresentam uma série de dificuldades devido à imprecisão da diferenciação entre os leucócitos e os trombócitos durante a quantificação direta na câmara de Neubauer. Os leucócitos são células que desempenham papel na atividade nos processos inflamatório e imunológico nos tecidos de mamíferos (GARCIA-NAVARRO e PACHALY, 1998), o mesmo é afirmado em peixes (SILVA et al., 1998; RANZANI-PAIVA et al., 2004; TAVARES-DIAS e MORAES, 2004). Já os trombócitos são células responsáveis pelo processo de coagulação sangüínea (YASUTAKE e WALES, 1983; TAKASHIMA e HIBIYA, 1995; MATUSHIMA e MARIANO, 1996; HRUBEC e SMITH, 1998;). No entanto, de acordo com TAVARESDIAS et al. (1999; 2000) e TAVARES-DIAS e FAUSTINO (1998) e TAVARES DIAS et al. (2007) os trombócitos, embora não sejam de linhagem leucocitária, foram considerados como células sangüíneas de defesa, predominante em várias espécies dulciaqüícolas. Esta hipótese é corroborada por NAKAGHI et al. (1995), onde localizaram citoquimicamente em trombócitos de pacu a presença de fosfatase ácida, que é uma enzima com atividade digestiva e peroxidase, uma enzima com atividade oxidativa nos processos de fagocitose. Além disso, MATUSHIMA e MARIANO (1996) observaram a migração predominante de trombócitos no exsudato presente na luz da bexiga natatória após diferentes tempos de injeção do irritante carragenina. Por outro lado, HRUBEC e SMITH (1998) e PITOMBEIRA e MARTINS (1966) recomendam a contagem de leucócitos totais pela metodologia indireta com o objetivo de diferenciar os trombócitos dos leucócitos e para isso partem da contagem de eritrócitos na câmara de Neubauer e da contagem de leucócitos em extensões sangüíneas. De acordo com HRUBEC e SMITH (1998) através da contagem em extensões sangüíneas, é possível diferenciar com maior confiabilidade os trombócitos dos linfócitos.

Este trabalho teve como objetivo avaliar e comparar duas metodologias de quantificação (direta x indireta) de leucócitos totais em Oreochromis niloticus através de teste experimental em laboratório.

Material E Métodos

O experimento foi realizado na Unidade Laboratorial de Referência em Patologia de Organismos Aquáticos do Instituto de Pesca de São Paulo.

As tilápias, Oreochromis niloticus foram adquiridas de uma piscicultura comercial. O lote foi composto por 250 indivíduos com peso médio de 27,13 ± 4,67 g. O período de aclimatação foi de 96 horas em caixa de amianto, preenchidas com água declorada e providas de aeração artificial. Neste período os peixes foram alimentados com ração comercial e ficaram em observação a fim de monitorar as possíveis variações (estresse, parasitismo e mortalidade,) que pudessem interferir negativamente no experimento. Após este período, os peixes foram transferidos para aquários com capacidade para 40 L de água, com sistema de aeração artificial, em densidade de 16 peixes por aquário.

Quatro grupos experimentais foram determinados ao acaso, com três repetições cada, totalizando a utilização de 12 aquários e 192 peixes.

Para as análises sanguíneas, os peixes foram retirados dos aquários, anestesiados com benzocaína e o sangue coletado por punção caudal, com auxílio de seringas descartáveis previamente heparinizadas. As punções foram realizadas em dois indivíduos por aquário, totalizando seis de cada grupo, nos intervalos; 0, 3, 7 e 10 dias de experimentação. Os peixes utilizados nas punções sanguíneas foram retirados do experimento.

56ISHIKAWA, N. M. et al.

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A partir das amostras de sangue foram obtidas as contagens de eritrócitos e leucócitos totais (contagem direta) em câmara de Neubauer, utilizandose a solução de NATT e HERRICK (1952) como diluente na proporção de 1:200. Os eritrócitos foram quantificados nos cinco quadrantes secundários do quadrado central e os leucócitos foram quantificados nos quatro quadrados laterais.

A contagem indireta dos leucócitos totais foi realizada segundo metodologia proposta por HRUBE e SMITH (1998). Para tanto, foram preparadas extensões sangüíneas, coradas em seguida pelo May-Grunwald-Giemsa segundo ROSENFELD (1947). Nesta metodologia de quantificação, foram contados aproximadamente 2000 eritrócitos de cada extensão, e o número de leucócitos e trombócitos. Os números totais de leucócitos e trombócitos foram estimados através da relação do número de eritrócitos totais (obtidos na câmara de Neubauer), segundo a fórmula:

Leucócitos totais (por µL) = NL x NE (por µL)/2000

(HRUBE e SMITH, 1998) onde: NL: número de leucócitos NE: número de eritrócitos (Câmara de Neubauer) 2000: 2000 eritrócitos contados na extensão sangüínea

As variáveis físicas e químicas da água foram monitoradas diariamente: Temperatura (oC), através de termômetro de coluna de mercúrio; pH e condu- tividade elétrica (µScm-1), através de aparelhos de medição digital por eletrodo.

Durante os 10 dias de experimentação, a alimentação dos peixes foi fornecida com ração extrusada na proporção de 1% de peso vivo logo após as coletas de sangue. Posteriormente, foi realizado a sifonagem das fezes. Neste processo foram realizadas as trocas de 1/3 do volume da água dos aquários.

Os dados foram expressos em média ± desvio padrão (DP). A estatística foi realizada por análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey com significância a 5% (p< 0,05).

Resultados De Discussão

Os resultados obtidos para os parâmetros indicadores de qualidade de água apresentado na TABELA 1 não variaram significativamente entre os tratamentos (p>0,05), com exceção somente para a condutividade. A temperatura foi mantida a 25,38±1,04oC, pH a 7,01±0,58 e condutividade 128,36±38,06 µcm/. Segundo KUBITZA (2000), os níveis destas variáveis se encontram na faixa ideal de conforto para a espécie.

No processo da punção sanguínea foi determinada a utilização do anticoagulante heparina, por ser natural e sem restrições para análises de ións sanguíneos. Além disso, muitos trabalhos demonstraram bons resultados deste anticoagulante em estudos hematológicos em peixes (RANZANIPAIVA e SILVA-SOUZA, 2004; RANZANI-PAIVA et al., 2004; RANZANI-PAIVA et al, 2005; ISHIKAWA et al., 2007).

TABELA 1 – PARÂMETROS FíSICOS DA ÁGUA NO EXPERIMENTO COM O. NILOTICUS, SÃO PAULO, 2003.

Grupo pH Condutividade (µS/cm) Temperatura (oC) 16,7 ± 0,25 a126,73 ± 39,19 b25,43 ± 1,10a 27,03 ± 1,02 a112,8 ± 31,29 c25,28 ± 1,12 a 37,03 ± 0,72 a133,28 ± 40,38 ab25,34 ± 1,01a 47,2 ± 0,39 a140,56 ± 47,73 a25,48 ± 1,02a CV (%)3,973,910,43

MÉDIAS EM MESMA COLUNA SEGUIDA DE MESMA LETRA NÃO DIFEREM SIGNIFICATIVAMENTE (P>0,05)

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Os valores médios de leucócitos quantificados pela metodologia direta e indireta estão apresentados na TABELA 2 e FIGURA 1. Segundo os dados percebe-se declínio nos valores médios de leucócitos totais em ambas as metodologias testadas, sendo mais pronunciado no terceiro dia de experimentação. GILL e PANT (1985) atribuem esta alteração ao fator estresse de experimento que também é demonstrado em vários vertebrados.

Segundo BENFEY e BIRON (2000), Oncorhynchus mykiss e Salvelinus fontinalis submetidos ao estresse de confinamento e manipulação apresentaram diminuição do número de leucócitos e ligeiro aumento do número total de trombócitos. Esses autores mencionam a hipótese de que o estresse leva a uma redistribuição dos linfócitos, principalmente nos órgãos linfóides, diminuindo-os na circulação sangüínea, ou a destruição dos linfócitos em resposta ao alto nível de cortisol. Esta última hipótese é confirmada por WOJTASZEK et al. (2002), que observaram profunda linfopenia e eosinopenia em Cyprinus carpio após 24 horas da inoculação de cortisol.

Houve interação significativa (p<0,01) entre as médias das metodologias testadas sobre os tempos de coletas das amostras (TABELA 2). Observou-se na terceira coleta (sétimo dia), que os leucócitos quantificados pela metodologia direta apresentou média superior ao da metodologia indireta. E, além disso, pela análise da FIGURA 1, verificou-se que a metodologia direta apresentou grande oscilação entre as médias, o oposto foi observado na metodologia indireta, que apresentou maior homogeneidade entre as médias observadas nos diferentes tempos de coletas. Esta afirmação é corroborada pelos dados do desvio padrão das médias apresentadas na TABELA 2, onde através da metodologia direta verificou-se valores superiores aos encontrados pela metodologia indireta em todos os tempos de coletas, evidenciando assim maior variação dos dados entre as repetições.

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