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Proteína recombinante ECP - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica

Apostilas de Bioquímica sobre o estudo da proteína recombinante ECP em E. coli e gel de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida para confirmação da expressão.

Tipologia: Notas de estudo

2013

Compartilhado em 14/03/2013

Lula_85
Lula_85 🇧🇷

4.5

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Baixe Proteína recombinante ECP - Apostilas - Bioquímica e outras Notas de estudo em PDF para Bioquímica, somente na Docsity! UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI CCO-DONA LINDU – DIVINÓPOLIS – MG Relatório de Práticas em Biologia Molecular EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE EM E. coli E ELETROFORESE EM GEL DESNATURANTE SDS-PAGE Turma: Bioquímica - 6º período II. INTRODUÇÃO O sistema de expressão de proteínas heterólogas mais comumente usado é o que utiliza a Escherichia coli como célula hospedeira. Este sistema é amplamente difundido devido à facilidade e baixo custo de cultivá-la em condições laboratoriais, e pela reprodutibilidade e abundância de proteína que produz. Além disso pode suprir de imediato necessidades da pesquisa básica, tais como, produção de anticorpos e purificação destes por afinidade, sondas em experimentos variados e para estudos funcionais/estruturais da proteína expressa. Permite, também, a expressão em grande escala, para fins industriais ou clínicos de enzimas, hormônios, anticorpos, etc., quando a atividade da proteína é preservada. A descoberta de promotores e repressores específicos do genoma de E. coli, permitiu a manipulação da expressão de proteínas e a clonagem de genes sob o controle de um dado promotor, cuja expressão pode ser indutível ou contínua. O primeiro, e mais comumente usado, sistema de expressão de proteínas heterólogas em E. coli é baseado no operon lac . Neste sistema, o DNA de interesse é clonado em fago ou plasmídeo contendo o lacI (repressor), lacP (promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito para mRNA da b-galactosidase). A indução da transcrição é obtida pela adição de um análogo de lactose sintético e não degradável (isopropiltio-b-D-galactosídeo, IPTG), o qual se associa ao repressor e inibe-o, deixando o promotor livre para a interação com a RNA polimerase e consequente transcrição do gene1. Deve-se levar em consideração algumas características do inserto e do vetor antes da clonagem para que seja sintetizada corretamente a proteína de interesse. É necessário respeitar o sinal de tradução de genes procarióticos (sinal de Shine-Dalgarno), ou seja, o DNA deve ser clonado de maneira que sua fase de leitura correta fique em fase com o ATG iniciador. Além disso, um vetor para expressão em E. coli deve apresentar uma origem de replicação; um gene que confira resistência a antibióticos; um promotor para transcrição forte e regulável ; um MSC para facilitar a inserção do gene de interesse na orientação correta e um tag específico que permita a fácil purificação da proteína, no caso a cauda de histidina. A partir de análises in silico, utilizando ferramentas computacionais específicas, pode-se verificar a existência de códons não usuais e também de modificações pós-traducionais que ajudarão na melhor escolha do vetor para a clonagem do inserto de DNA em interesse. Vários vetores encontram-se disponíveis no mercado para a expressão de proteínas em E.coli. Os mais referidos são da série pET (plasmid for expression by T7 RNA polimerase). A grande vantagem deste vetor é que ele é transcrito pela T7 RNA polimerase, a qual é muito seletiva e ativa, sendo capaz de elongar cadeias de RNA aproximadamente 5 vezes mais rápido que a RNA polimerase de Escherichia coli 1. Para verificar a expressão da proteína ECP, foi realizada a eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE). A eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração de moléculas carregadas, numa solução, em função da aplicação de um campo elétrico 2. Diferentes suportes podem ser utilizados, na forma de géis poliméricos, como por exemplo gel de poliacrilamida. Na eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) as proteínas migram através dos poros do gel em resposta a um campo elétrico. O tamanho desses poros diminuem para concentrações crescentes de acrilamida. A facilidade com que as proteínas migram através do gel é condicionada pelo tamanho dos poros do gel e pelo peso molecular das proteínas 3. Considerando um determinado tamanho de poro, tem-se que quanto menor for o peso molecular da proteína mais facilmente ela migrará em relação as proteínas de alto peso molecular. A percentagem de acrilamida do gel deve ser escolhida tendo em consideração o peso molecular da proteína que se quer identificar. A solução de acrilamida é estável por mês. Quando estocada por períodos prolongados, transforma-se em ácido acrílico, que pode causar distorções no gel. É importante frisar que a acrilamida é fotossensível e neurotóxica, devendo, portanto, ser estocada em frasco escuro e manuseada com o maior cuidado possível. Antes de iniciar a eletroforese, as variáveis forma e carga nativa das proteínas devem ser eliminadas para que a separação dependa de sua massa molecular. Para isso, as proteínas são misturadas com SDS, um detergente anfipático cuja função é desnaturá-las, ou seja, convertê-las numa estrutura linear- a forma nativa é geralmente globular- e conferir-lhes densidade de carga uniforme. Na ausência de SDS, as proteínas com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel devido ao diferencial de cargas de suas estruturas tridimensionais 2 . As proteínas são aplicadas no topo do gel de poliacrilamida e submetidas a uma corrente elétrica, fazendo com que elas migrem através da malha de acrilamida em direção ao pólo positivo. Finalmente, pode-se visualizar as proteínas no gel corando-as com prata ou com um corante como o Coomassie Blue. III. OBJETIVO Expressão da proteína recombinante ECP em E. coli e gel de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida para confirmação da expressão. IV. METODOLOGIA A. Expressão de proteína recombinante em E. coli Em um tubo tipo falcon de 50 ml contendo 10 ml de meio LB líquido, foi adicionado 10μl da solução estoque de ampicilina (100 mM). 1 mL do meio LB, sem ampicilina, foi reservado para ser usado como “blank” no nanodrop. Em seguida, 300μl do caldo de bactérias (transformadas com o plasmídeo contendo o gene de interesse) crescido no dia anterior foi adicionado ao tubo com LB. O meio foi encubado sob agitação a 37º C e 180 rpm até começar a turvar (aproximadamente 3 horas). Assim que iniciou-se a turvação, a O.D. 600 (optical density 600nm) foi medida no espectrofotômetro. Para calibrar o aparelho, usou-se o meio aliquotado em tubo de 1.5ml, “blank”. A O.D. foi medida a cada 20 min até que ficasse entre 0.6 e 0.8. Metanol 450 mL Ácido acético glacial 100 mL Água Milli-Q 450 mL V. RESULTADOS Nas canaletas 6, 7 e 8, correspondentes ao nosso grupo, não houve aparecimento de bandas características de expressão em T0, T2 e T4. A proteína ECP possui 16 kDa portanto sua banda deve estar compreendida entre a primeira e a segunda banda do gel, conforme indicado pelas setas. Foto do gel Fonte: Mapa do gel: 1ª canaleta: padrão de peso molecular Broat- Promega + tampão de amostra 2X 2ª,3ª e 4ª canaleta: amostras de outro grupo 5ª canaleta: sem amostra 6ª canaleta: 10 µL de T0 + tampão de amostra 2X 7ª canaleta: 6 µL de T2 + tampão de amostra 2X 8ª canaleta: 4,3 µL de T4 + tampão de amostra 2X 9ª canaleta: padrão de peso molecular Broat- Promega + tampão de amostra 2X Medidas de densidade ótica a 600nm T0 – 1,026 T2 - 1,786 T4 – 2,415 VI. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO Primeiramente, fez-se necessário reservar 1mL do meio de cultura 2XYT para ser usado com “blank” no nanodrop a fim de que a OD lida das amostras posteriores seja correspondente apenas ao número de células presentes, o que aumenta a turbidez do meio. O tubo correspondente a T0, que continha o caldo de bactérias (crescido no dia anterior) transformadas com o plasmídeo contendo o gene ecp, cresceu por aproximadamente três horas em shaker a 37° C satisfazendo a temperatura ótima de crescimento de bactérias mesófilas como a E. coli e a 180 rpm para melhor homogeneização e aeração do meio. A OD a 600 nm ideal para T0 está compreendida entre 0,6 e 0,8, momento em que as células atingiram a fase log, portanto tem uma maior taxa de cresimento sendo preferível para expressão. A OD medida para T0 a 600 nm foi de foi de 1,026. Uma alíquota de T0 foi reservada para posterior aplicação no gel de SDS-PAGE. O próximo passo foi a adição do indutor IPTG ao tubo que após duas horas de incubação foi nomedo T2. O IPTG é um indutor da transcrição que atua associando-se ao repressor (que neste caso é o repressor lacI do vetor pET-21) e inibindo-o. Dessa forma, o promotor fica livre para a interação com a RNA polimerase e consequente intensificação da transcrição do gene1. A OD medida pra T2 foi de 1,786. O aumento observado na absorbância reflete uma maior turbidez do meio que se deve ao crescimento bacteriano, como era esperado após o período de incubação. Foi também reservada uma alíquota de T2 para posterior aplicação em gel. Após quatro horas de incubação obteve-se T4 que teve OD de 2,415. Da mesma forma, foi observado aumento de cresimento bacteriano. Reservou-se também alíquota para aplicação em gel. Os tubos correspondentes a T0, T2 e T4 foram centrifugados e o sobrenadante foi descartado já que é no pellet que se encontra, além das estrututras celulares e outras proteínas, a proteína de interesse (ECP). Os diferentes tempos de crescimento bacteriano (T0, T2 e T4) foram utilizados para avaliação da expressão. Em TO há um nível basal de expressão gênica devido ao repressor que mantem os níveís basais de expressão do gene insignificantes até a indução. Já em T2, o nível de expressão é aumentado pela adição de IPTG e em T4 espera-se um nível de expressão ainda maior, já que além do indutor há o fator tempo de crescimento bacteriano aumentado. Essa expressão pode ser constatada pela análise de gel de acrilamida desnaturante SDS-PAGE. Essa técnica permite a visualização dos resultados da expressão protéica para posterior purificação da proteína em questão e sua utilização em testes funcionais. O gel de poliacrilamida que contem ligações altamente cruzadas como uma matriz inerte, através da qual as proteínas migram. O gel é preparado pela polimerização de monômeros. O tamanho do poro do gel foi ajustado de maneira que fosse suficientemente pequeno para retardar a migração das moléculas protéicas de interesse. Para tanto foi usado o gel de corrida a 10%. É também usado um gel de empacotamento a 5% a fim de que as amostras atinjam o gel de corrida linearmente. Conforme dito anteriormente, as proteínas são misturadas com um detergente aniônico capaz de se ligar a elas e desnaturá-las, o SDS, que é usado para que as proteínas migrem no gel apenas de acordo com sua massa molecular, proteínas com menor peso molecular terão migração maior por ficarem menos retidas na malha do gel. O SDS aplica uma carga negativa à proteína em proporção à sua massa se ligando às suas regiões hidrofóbicas, dessa forma as diferenças de massa e carga não influenciam na migração no gel. Como resultado, uma mistura complexa de proteínas é fracionada em uma série de diferentes bandas de proteínas arranjadas de acordo com sua massa molecular. As proteínas são detectadas pela coloração com o corante azul de Comassie 5. O Coomassie complexa com aminoácidos básicos (afinidade principalmente a lisinas e argininas e pouca afinidade por aminoácidos com cadeia lateral aromática) por interações não-covalentes . O Coomassie possui sensibilidade para detectar de 30 a 100 ng de proteína 6. O excesso do corante foi removido com solução descorante. Após corrida do gel, a expressão protéica pôde ser avaliada pela intensidade da banda corada por Comassie. Como dito anteriormente, há uma maior expressão em T2 e principalmente em T4. Portanto, espera-se uma banda muito pouco intensa em T0, um aumento da intensidade da banda em T2 e uma banda bastante intensa em T4. A proteína ECP expressa em aula prática tem peso de 16 kDa devendo aparecer entre a primeira e a segunda banda do padrão Broat Ranger Marker – Promega. Porém, como observado no gel nosso grupo não obteve resultado positivo. Isso pode ter ocorrido devido a diversos fatores, como falha na transformação bacteriana ou no crescimento ou ainda na indução da expressão. Acreditamos que o erro mais provável seja na pipetagem em algumas das fases mesmo em aulas práticas anteriores visto que as mesmas são sequenciais, e não nos reagentes uma vez que outro grupo obteve resultado positivo. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Tecnologia do DNA recombinante. Alexandra A. C. Nascimento;Enilza Maria Espreafico; Maria Luisa Paçó Larson Nádia Monesi; Nilce Maria Martinez Rossi;Vanderlei Rodrigues. São Paulo, 2003. Disponível em: <http://morpheus.fmrp.usp.br/td/apostila/apost10.htm > Acesso em: 25 de outubro de 2010 2 Comunicado técnico – EMBRAPA . Eletroforese dimensional e análise de proteomas. Thales Lima Rocha; Paulo Henrique Alves da Costa ; José Cesamildo Cruz Magalhães; Raphael Garcia Souza Evaristo; Érico Augusto Rosas de Vasconcelos; Marise Ventura Coutinho; Norma Santos Paes; Maria Cristina Mattar da Silva; Maria de Fátima Grossi de Sá. Disponível em: < http://www.cenargen.embrapa.br/laboratorios/LIMPP/PDFsLIMPP/cot136.pdf > Acesso em: 27 de outubro de 2010. 3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA. Separação de proteínas por eletroforese desnaturante descontínua na presença de SDS (SDS-PAGE). Prof. Antônio Augusto Ulson de Souza. Disponível em: <www.enq.ufsc.br/disci/eqa5517/pratica_eletroforese.doc > Acesso em: 27 de outubro de 2010.
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