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Faculdade de Estudos Superiores Débora Tocafundo de Souza Marina Celeste Martins Rita de Cássia Lima Morais Sabrina Campos da Silva Suzielle Lorem Leonel Guimarães TÉCNICAS HISTOLÓGICAS - 2 - Belo Horizonte 2010 ______________________________________________________________________ Débora Tocafundo de Souza Marina Celeste Martins Rita de Cássia Lima Morais Sabrina Campos da Silva Suzielle Lorem Leonel Guimarães ÍNDICE 1 .............................................................................................................................. 2 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 2 3 PREPARAÇAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCÓPICO..................................... 3 4 MICROSCOPIA DE LUZ........................................................................................... 7 5 MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA................................................................................................................. 8 6 MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO.......................................................................... 8 7 MICROSCOPIA CONFOCAL.................................................................................... 9 8 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA....................................................................... 9 9 MICROSCOPIA ELETRÔNICA.................................................................................. 10 10 .............................................................................................................................. 11 RADIOAUTOGRAFIA EM SECÇÕES DE TECIDOS..................................................... 12 12 CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS.......................................................................... 12 13 FRACIONAMENTO CELULAR.................................................................................. 13 14 HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA........................................................................... 13 15 DETECÇÃO DE MOLÉCULAS EM CORTES HISTOLÓGICOS POR MEIO DE INTERAÇÃO MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE .................................................................................. 17 16 PROBLEMAS NA INTERPRETAÇÃO DE CORTES...................................................... 21 17 CONCLUSÃO.......................................................................................................... 22 18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 23 INTRODUÇÃO A Histologia é o estudo da estrutura do material biológico e das maneiras como os seus componentes se inter-relacionam, tanto estrutural quanto funcionalmente. O estudo da histologia se iniciou com o desenvolvimento de microscópios simples e de técnicas para preparo de material biológico, tornando-o adequado para exame. Este trabalho apresenta os métodos de estudos desenvolvidos para histologia, englobando a preparação de cortes de tecidos em lâmina e o uso de microscópios utilizados para visualização. O pequeno tamanho das células e dos componentes da matriz torna a histologia dependente do uso de microscópios. Além disso, pesquisas em química, fisiologia, imunologia e patologia são fundamentais para um conhecimento adequado da biologia, dos tecidos e dos órgãos e de como seus vários componentes interagem na saúde e na doença. O conhecimento das ferramentas e dos métodos de investigação é essencial para uma compreensão adequada da estrutura e funcionamento das células, tecidos e órgãos. Histologia é o estudo dos tecidos do corpo e de como estes se organizam para construir órgãos. Há quatro tecidos fundamentais: tecido epitelial, tecido conjuntivo, tecido muscular e tecido nervoso. Os tecidos são constituídos por células e por matriz extracelular (MEC). As células produzem a MEC e são ao mesmo tempo influenciadas e controladas por moléculas da matriz, há uma integração onde células e MEC formam uma entidade contínua que funcionam conjuntamente e responde de modo coordenado às exigências do organismo. Cada um dos tecidos fundamentais é formado por vários tipos de células características daquele tecido, e por associações e arranjos característicos entre célula e matriz extracelular, mas estas associações são muito peculiares. Por outro lado, analisando o nível de organização dos órgãos, observamos que estes são quase sempre formados por uma associação muito precisa de vários tecidos. Esta associação de tecidos resulta no funcionamento adequado de cada órgão e do organismo como um todo. O sistema nervoso é a exceção, pois é constituído quase somente por tecido nervoso. PREPARAÇAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCÓPICO O procedimento mais usado no estudo de tecidos ao microscópio consiste na preparação de cortes histológicos. No microscópio de luz (óptico ou fotônico) a imagem se forma após um feixe de luz atravessa alguma estrutura. Células vivas, camadas muito delgadas de células ou de tecidos, membranas transparentes de animais vivos podem ser observadas diretamente ao microscópio. No entanto, na maioria dos casos os tecidos e órgãos são espessos e não permitem a passagem adequada de luz para formação de uma imagem; antes de serem examinados no microscópio eles devem ser fatiados em secções muito delgados que serão colocados sobre lâminas de vidro. Os cortes são obtidos por instrumentos de grande precisão chamados micrótomos, mas antes os tecidos precisam passar por uma série de tratamentos que serão descritos a seguir: • Fixação Células ou fragmentos de tecidos e órgãos, assim que retiradas do corpo, são submetidas a um processo de fixação. Ela tem várias finalidades: evitar a digestão dos tecidos por enzimas presentes nas próprias células (autólise) ou em bactérias; endurecer os fragmentos; preservar em grande parte a estrutura e a composição molecular dos tecidos. Pode ser feita por métodos químicos ou, menos freqüentemente, por métodos físicos. Na fixação química os tecidos são imersos em soluções de agentes desnaturantes ou de agentes que estabilizam as moléculas formando pontes com moléculas vizinhas (soluções chamadas de fixadoras). Como pode demorar para que os fixadores se difundam pelo interior dos fragmentos, é bom que a amostra seja cortada em fragmentos menores, facilitando a penetração do fixador no fragmento e garantindo uma melhor preservação da estrutura. Alternativamente, pode se usar a perfusão intravascular do fixador, alcançando a intimidade dos tecidos rapidamente pelos vasos sanguíneos, sendo a fixação melhor. Um dos fixadores mais comuns para a microscopia de luz é uma solução isotônica tamponada de formaldeído a 4%. Formaldeído e glutaraldeído, outro fixador extensamente usado, são conhecidos por reagir com os grupos amina (NH2) das proteínas. Devido à alta resolução oferecida pelo microscópio eletrônico, é necessário um cuidado maior na fixação para melhor preservar os detalhes da ultra- estrutura das células e da matriz. Para esta finalidade uma fixação dupla de glutaraldeído tamponado, seguida por uma segunda fixação em tetróxido de ósmio, (como porções do citoplasma rica em RNA e matriz da cartilagem hialina). A eosina cora o citoplasma e o colágeno em cor - de rosa. São usados também os tricrômicos (como os corantes de Mallory e de Masson), mostra bem o núcleo e o citoplasma, ajudam a diferenciar colágeno e músculo liso entre si. Uma técnica boa pra diferenciar colágeno é o uso do picro-sirius associado com luz polarizada. Em muitos procedimentos as estruturas são evidenciadas por um precipitado ou por um corante fluorescente, mas as células e os seus limites não são visíveis. Neste caso é usado um contratransporte – trata-se de um corante aplicado a um corte para permitir a visualização dos contornos das células ou núcleos. Uma outra maneira de evidenciar componentes de células e tecidos é a sua impregnação por metais, como prata e ouro, método comum para estudar tecido nervoso. O procedimento inteiro pode demorar de 12 h à dois dias, dependendo do tamanho do tecido, do fixador e do meio de inclusão utilizados. MICROSCOPIA DE LUZ No microscópio de luz, as preparações coradas são examinadas por iluminação que atravessa o espécime. O microscópio é composto por partes mecânicas e ópticas. O componente óptico tem três lentes: condensadora, objetivas e oculares. O condensador concentra a luz de uma lâmpada e projeta um feixe luminoso sobre o espécime. A objetiva recebe a luz que atravessou o espécime e projeta uma imagem aumentada do objeto em direção a ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta na retina, em uma tela, em uma câmera fotográfica ou em um detector eletrônico. No caso das imagens projetadas na retina, a ampliação total é calculada multiplicando-se o aumento da objetiva pelo aumento da ocular. • Resolução Poder de resolução é definido como a menor distância entre duas partículas ou entre duas linhas a qual permite que elas sejam vistas como dois objetos separados. O poder de resolução máximo do microscópio de luz é de aproximadamente 0,2 um; esta resolução permite a obtenção de boas imagens aumentadas ate 1000 a 1500 vezes. Objetos menores que 0,2 um não podem ser distinguidos com este instrumento. Dois objetos serão vistos como um só objeto se eles estiverem separados por menos de 0,2 um. Aumentar só tem valor pratico se for acompanhado de resolução que depende essencialmente da objetiva, pois a lente ocular apenas aumenta a imagem nela projetada pela objetiva. Esta sendo ampliada o uso de vídeo-cameras de alta sensibilidade e resolução que permitem a digitalização de imagens que podem ser usadas em computadores para analisa quantitativa por meio de aplicativos de analise de imagens. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA Sistemas ópticos que permitem a observação de células e cortes não corados. Microscopia de contraste de fase usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de objetos quase transparentes. A microscopia de contraste de fase é baseada no fato de que a luz muda sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham índices de refração diferentes. Estas mudanças são usadas pelo sistema de contrastes de fase para fazer com que as estruturas apareçam mais claras ou mais escuras e fazem deste tipo de microscopia uma ferramenta para observar células vivas. A microscopia de contraste diferencial produz uma imagem aparentemente tridimensional. MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO Quando raios de luz passam através de um filtro polarizador (como um Nicol ou um filtro Polaroid), eles saem vibrando em uma só direção. Um segundo filtro colocado com seu eixo principal perpendicular ao primeiro filtro bloqueará a passagem da luz. Se um tecido que tiver estruturas formadas por átomos e moléculas com um alto grau de orientação (como celulose, colágeno, cristais, microtúbulos e microfilamentos) for colocado entre os dois filtros, a estrutura molecular repetitiva e orientada modifica o plano de vibração da luz que emerge do primeiro filtro, fazendo com que estas estruturas apareçam luminosas contra um fundo escuro após passarem pelo segundo filtro. A capacidade que estruturas têm de girar o plano de vibração da luz polarizada é chamada birrefringência. MICROSCOPIA CONFOCAL Geralmente na imagem há superposição de vários planos os quais aparecem em foco simultaneamente, causando um certo grau de deterioração da imagem. Há um microscópio confocal, que torna possível focalizar um plano muito delgado do espécime. O espécime é iluminado com um feixe de luz muito estreito; a imagem coletada do espécime deve passar por um orifício muito pequeno; só a imagem originada do plano focalizado alcança o detector, enquanto as imagens de planos anteriores e posteriores são bloqueadas. A luz proveniente de fora do plano de foco é eliminada, a definição do objeto focalizado fica melhor e a localização dos componentes do espécime pode ser feita com muito mais precisão que no microscópio de luz. Arranjo usado na maioria dos microscópios confocais: a iluminação é freqüentemente provida por uma fonte de laser; como esta fornece um ponto de iluminação muito pequeno, ele deve ser varrido sobre o espécime para permitir a observação de uma área muito maior do espécime; o componente do espécime que é de interesse deve ser marcado com uma molécula fluorescente; a luz usada para formar uma imagem é aquela que é refletida pelo espécime; a luz refletida é capturada por um detector, onde o sinal é amplificado eletronicamente para ser visto em um monitor. Como somente um plano focal muito delgado é focalizado de cada vez, é possível reunir os vários planos de um espécime e reconstruí-los em um objeto tridimensional. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA Quando algumas substâncias são irradiadas por luz de certo comprimento de onda, elas emitem luz com um comprimento de onda mais longo. Este fenômeno é a RADIOAUTOGRAFIA EM SECÇÕES DE TECIDOS Permite o estudo funcional de processos biológicos em cortes de tecidos pelo uso de radioatividade, aproveitando a capacidade de algumas substancias radioativas sensibilizarem emulsões fotográficas. Cristais de brometo de prata presentes na emulsão fotográfica funcionam como detectores de radioatividade da mesma maneira como eles respondem à luz em um negativo fotográfico. A primeira etapa é fornecer átomos ou moléculas radioativas às células. A escolha destas substâncias depende da finalidade do estudo: aminoácidos radioativos, nucleotídeos radioativos, açucares radioativos etc. Estas moléculas são chamadas de precursores, porque podem ser usadas pelas células para sintetizar moléculas maiores como proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e glicoproteinas. Cortes dos tecidos a serem analisados são cobertos por uma emulsão fotográfica. Depois de um tempo, as lâminas passam por uma revelação fotográfica e são depois examinadas ao microscópio. Os cristais da emulsão que foram atingidos por radiação originam pequenos grânulos pretos de prata metálica que indicam a existência de radioatividade no tecido. As estruturas do corte que contem moléculas radioativas ficam cobertas por estes grânulos. Este procedimento pode ser usado tanto em microscopia de luz como eletrônica. Se o precursor fornecido tiver sido um aminoácido radioativo é possível conhecer quais células de um tecido produzem mais e quais produzem menos proteínas, porque o numero de grânulos de prata existentes sobre as células é proporciona à intensidade de síntese de proteína. Se for usado um precursor radioativo de DNA (como timidina radioativa), é possível determinar quais e quantas células de um tecido estão se preparando para se dividir. CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS Células podem ser mantidas vivas e estudadas fora do corpo sendo muito útil para estudar o efeito isolado de moléculas sobre um determinado tipo de células ou tecido. A cultura de células permite também a análise direta do comportamento de células vivas por meio de um microscópio e de varias experiência que podem ser executadas em um animal vivo pode ser feitas in vitro. As células e os tecidos são cultivados em soluções de composição conhecida (sais, aminoácidos, vitaminas) às quais são freqüentemente adicionados componentes do soro. Para preparar devem ser inicialmente separadas mecanicamente ou por meio de tratamento enzimático. Uma vez isoladas as células podem ser cultivadas em suspensão ou podem ser colocadas sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamínula de vidro, superfícies sobre as quais elas costumam aderir e crescer sob forma de uma única camada de células. Culturas feitas desta maneira são culturas primarias. A maioria das células obtidas de tecidos normais tem uma duração de vida finita, programada geneticamente. Muitos tipos de células originalmente isolados a partir de tecidos normais ou patológicos e mantidos in vitro constituem agora linhagem permanente de células. Para permitir a “imortalidade” de células normais in vitro há necessidade submetê-las a um processo chamado de transformação. Todos os procedimentos com células e tecidos vivos devem obviamente ser executados em uma área estéril e usando-se soluções e equipamentos estéreis. FRACIONAMENTO CELULAR Organelas e outros componentes das células e tecidos podem ser purificados e isolados por meio de uma técnica chamada fracionamento celular. É um processo físico pelo qual é usada a força centrifuga para separar as organelas e componentes celulares em função de seus coeficientes de sedimentação que depende de seu tamanho, forma, densidade e viscosidade do meio em que esta suspensa. A composição química e funções das organelas e moléculas podem então ser estudadas in vitro. As frações obtidas por estas técnicas podem ser analisadas ao microscópio eletrônico para verificar sua pureza. HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA Estes termos são usados para indicar métodos que identificam e localizam substancias em cortes histológicos ou em células cultivadas. Há vários procedimentos para obter estas informações, a maioria baseada em reações químicas especificas ou em interações de alta afinidade entre moléculas. Estes métodos normalmente originam substancias insolúveis coloridas ou elétron-densas, que permitem a localização de átomos ou de moléculas por microscopia de luz ou eletrônica. • Íons Vários íons podem ser localizados em tecidos com estes métodos, usando reações químicas que produzem produtos insolúveis escuros ou coloridos. • Ácidos nucléicos O DNA pode ser identificado e quantificado nos núcleos das células por meio de reação de Feugen, que produz uma cor vermelha no DNA. O DNA e o RNA também podem ser evidenciados pela coloração de células ou de cortes de tecidos com corantes básicos. • Proteínas Embora haja métodos gerais para detectar proteínas e, células e cortes de tecidos, os métodos histoquímicos normalmente não permitem localização de proteínas específicas, o que pode ser feito pela imunocitoquímica Há, porém, vários métodos histoquímicos que revelam com maior ou menor especificidade um grupo grande de proteínas, as enzimas. Estes métodos normalmente aproveitam a capacidades das enzimas para reagir com ligações químicas especificas. A maioria dos métodos histoenzimáticos funciona do seguinte modo: 1) cortes de tecidos são imersos em uma solução que contem o substrato da enzima cuja presença se quer verificar, e desta maneira se permite enzimas se apresenta nas células ou matriz interaja com o seu substratos ; 2) Em seguida o corte é posto em contato com a substância marcadora que reage com uma molécula que deve ser insolúvel, precipita sobre o local que contém a enzima, denunciando-a; este produto final deve ser colorido ou elétron-denso para ser visível por microcospia de luz ou eletrônica. Ao examinar um destes cortes ao microscópico, é possível observar as células (ou organelas) cobertas com um material colorido ou elétron-denso. Alguns exemplos de enzimas que podem ser detectadas são: • Fosfatases são enzimas amplamente encontradas no organismo.Elas clivam a ligação entre um grupo fosfato e um resíduo de álcool de moléculas fosforiladas. O produto estas técnicas podem-se detectar fosfatases alcalinas que têm sua atividade máxima em um pH Sudan Black são os mais usados ).O corante de dissolve na gotículas de lipídios, as quais adquirem a cor do corante.Métodos adicionais usados para localização de colesterol e seus ésteres, de fosfolipídios e de glicolipídios são úteis para diagnostica doenças metabólicas em que há acúmulo intracelular de diferentes tipos de lipídios. DETECÇÃO DE MOLÉCULAS EM CORTES HISTOLÓGICOS POR MEIO DE INTERAÇÃO MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE Uma molécula presente em uma célula ou em um corte de tecido pode ser percebida por meio de compostos que interagem especificamente e ligam-se com a moléculas que queremos detectar.Os compostos capazes de fazer o reconhecimento devem ser previamente acoplados a um marcador, para que o conjunto molécula- compostomarcador possa ser visto por meio de um microscópico de luz ou eletrônico.Os marcadores mais usados são: substancia florescentes ( param serem visualizados como um microscópico de florescência ou de laser ), átomos radioativos (para serem detectados por radiofotografia), moléculas de enzimas como a peroxidase que pode ser detectadas pela demonstração da enzima com peróxido de hidrogênio e DAB, metais (geralmente partículas de ouro) que podem ser observados por microscopia de luz e eletrônica.Estes métodos se destinam principalmente para detectar açucares, proteínas e ácido nucléicos. Faloidina, proteína A lectinas e anticorpos são exemplos de compostos que interagem especificamente com outras moléculas . A Faloidina que é extraída de um cogumelo (Amanita phalloides ), interage fortemente com actina e é geralmente marcada com substancias fluorescentes para demonstrar filamentos de actina . A proteína A é uma proteína extraída Staphylococcus aureus que se liga à região Fc de moléculas imunoglobulinas (anticorpos). Quando a proteína A é ligada a um marcador, podemos detectar imunoglobulinas com grande precisão. As lectinas são proteínas ou glicoproteínas derivadas principalmente de sementes de vegetais que se ligam com alta afinidade e especificidade a carboidratos.Diferentes lectinas interagem com diferente açucares ou seqüências de açucares.Elas , portanto,se ligam a glicoproteínas, proteoglicanos e glicolipídios e são muito usadas para caracterizar moléculas de membranas celulares que contem seqüências especificas de açucares • Imunocitoquímica Uma interação altamente especifica entre moléculas é o que ocorre entre uma molécula e um anticorpo. Métodos que usam ante corpos marcados são de grande utilidade para identificar proteínas e glicoproteínas.A imunocitoquímica é metodologia que permite identificar moléculas ou camadas de células por meio de anticorpos. Em uma reação altamente imunocitoquímica, células em cultura ou um corte de tecidos que supõe conter uma determinada proteína são incubados em uma solução que contém um anticorpo que reconhece esta proteína. O anticorpo se liga especificamente à proteína e sua localização pode então ser evidenciada por microscopia de luz ou eletrônica, dependendo do marcador que foi acoplado ao anticorpo. Uma da exigência mais importantes da imunocitoquímica é a disponibilidade de um anticorpo contra a proteínas que se pretende detectar.Isto significada que a proteína deve ter sido previamente purificada e isolada de forma que anticorpos possam ser produzidos contra ela. -Anticorpos monoclonais e policlonais Suponhamos que se quer produzir anticorpos contra proteína X de certa espécie animal (um rato, um humano ) . Se x já esta isolada, ela é injetada em uma outra espécie (um coelho, uma cabra). Se a proteína é suficientemente diferente para este animal reconhecê-la como estranha, o animal produzira anticorpos contra a proteína. Estes anticorpos os são coletados do plasma o animal e usado para imunocitoquímica. Quando se oferece antígeno a um animal, vários grupos de linfócitos deste animal podem reconhecer porções diferentes de X e os grupos podem produzir anticorpos diferentes contra as varias porções, resultando em uma mistura de anticorpos chamado anticorpo policlonal. É possível fornecer a proteína X para linfócitos mantidos em cultura. Os diferentes grupos (clones) de linfócitos produzirão anticorpos diferentes contra as varias porções da proteína X. Cada clone pode ser isolado e cultivado isoladamente, de forma que os diferentes anticorpos contra X podem ser coletados e separados. Cada um destes anticorpos constitui um anticorpo monoclonal. Há varias vantagens em usar um anticorpo monoclonal em comparação com um anticorpo policlonal, eles costumam ser mais específicos havendo menos ligações inespecíficas com outras proteínas, o que poderia dificultar o reconhecimento da proteína X. Há fundamentalmente duas técnicas usadas em imunocitoquímica: Técnica direta de imonocitoquímica o anticorpo contra a proteína X é ligado a um marcador apropriado. Um corte de tecido é incubado com o anticorpo de forma que o anticorpo interage e se liga a X, e, a seguir, o corte é levado para remover o anticorpo não ligado. O corte é observado a microscopia de luz ou eletrônica, dependendo do marcador utilizado. Se o marcador foi peroxidase ou outra enzima, o corte deve ser colocado em contato com o substrato desta enzima antes de ser analisado. Os locais do corte que contem a proteína X ficarão fluorescentes, ou serão cobertos por um precipitado escuro ou coloridos devido à presença da enzima ou partículas de ouro. A técnica indireta de imunocitoquímica é mais sensível, porem requer mais etapas. Se quisermos detectar uma proteína X existente em tecidos de ratos, é necessário inicialmente produzir dois anticorpos diferentes: anticorpos contra a proteína X de rato feitos, por exemplo, por um coelho; em um procedimento paralelo, imunoglobulina de um outro coelho é injetada em uma terceira espécie. Imunoglobulina de coelho é considerada estranha por ovelhas ou cabras, que respondem produzindo um anticorpo contra a imunoglobulina, um antianticorpo ou antiimunoglobulina. Este anticorpo é, em seguida, ligado a um marcador adequado. Na primeira etapa da técnica indireta, um corte de tecido de rato que se supõe conter a proteína X é incubado inicialmente com anticorpo de coelho antiproteina X de rato. Depois de lavar os cortes, estes são incubados com o anticorpo marcado que reconhecerá e se ligará ao anticorpo de coelho que se havia ligado à proteína X. Em seguida o corte é observado ao microscópio de luz ou eletrônico após tratamento adequado, dependendo do marcador utilizado. Apesar de ser mais complexa, a técnica de imunocitoquímica é mais sensível, respondendo com um sinal maior que a técnica direta. Há métodos indiretos que envolvem uso de outras moléculas intermediárias, como a técnica que utiliza biotina-avidina. • Técnias de hibridização Quando uma estrutura tridimensional é cortada em secções muito delgadas, as secções parecem ter só duas dimensões: comprimento e largura. Is freqüentemente conduz o observador a erros se ele não conscientizar de que uma esfera seccionada é vista como um circulo e que um tubo seccionado é visto como um anel. Para entender a arquitetura de um órgão, é necessário estudar secções feitas em planos diferentes. Às vezes, somente a analise se secções consecutivas e a sua reconstrução em um volume tridimensional tornam possível compreender a organização de um órgão complexo. CONCLUSÃO A histologia hoje é muito importante em vários campos, no estudo dos tecidos, em diagnósticos pós-operatórios, no avanço da área médica. Como a histologia trabalha com partes muito pequenas de tecidos, células microscópicas, foi necessário o desenvolvimento de técnicas que possibilitassem um estudo mais preciso. Para cada tipo de tecido ou objetivo do pesquisador existe um método que irá se aplicar melhor. Mas para a utilização de cada método o pesquisador deve saber em que consiste a pesquisa e aplica lo de forma correta. Enfim, existem muitas técnicas que nos possibilitam visualizar tecidos, células melhorando assim o estudo da histologia que é uma ciência imprescindível para os avanços da medicina. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 11ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.