Baixe Farmacologia do câncer: transdução de sinais e outras Notas de estudo em PDF para Enfermagem, somente na Docsity! 38 Farmacologia do Câncer: Transdução de Sinais David A. Barbie e David A. Frank Introdução Caso Bioquímica da Transdução de Sinais Intercelulares e Intracelulares Fatores de Crescimento e Receptores de Fatores de Crescimento Vias de Transdução de Sinais Intracelulares Estrutura e Função do Proteassomo Angiogênese Classes e Agentes Farmacológicos Antagonistas dos Receptores de Fatores de Crescimento e de Transdução de Sinais Antagonistas do Receptor do EGF Inibição do BCR-ABL/C-KIT/PDGFR Inibidores de FLT3 Inibidores de JAKZ Inibição da Via de RAS/MAP Cinase Inibidores do mTOR Inibidores do Proteassomo Inibidores da Angiogênese Anticorpos AntiVEGF Inibidores do VEGFR Talidomida e Lenalidomida Anticorpos Monoclonais Específicos Contra Tumores Conclusão e Perspectivas Futuras Leituras Sugeridas INTRODUÇÃO Aterapiaantineoplásica tradicional consiste em agentes dirigidos contra a replicação do DNA e a divisão celular. Esses fármacos exibem certo grau de seletividade contra as células cancerosas, que tendem a apresentar uma maior fração de crescimento e, em alguns casos, uma suscetibilidade aumentada à lesão do DNA em comparação com as células normais. Entretanto, a janela terapêntica desses fármacos é estreita, com conseqiiente toxi- cidade para as células-tronco normais e efeitos adversos hema- tológicos e gastrintestinais. Com os avanços impressionantes da biologia básica das células tumorais nessas últimas décadas, e a identificação de numerosos oncogenes e genes supressores de tumor, existe o potencial de desenvolver agentes que tenham alvos mais específicos na circuitação molecular responsável pela proliferação descontrolada das células cancerosas. Um dos primeiros exemplos de um fármaco desse tipo é o modulador seletivo dos receptores de estrogênio, o tamoxifeno (ver Cap. 28), que tem sido um dos agentes mais ativos no tratamento do câncer de mama positivo para receptores de hormônios, com perfil relativamente modesto de efeitos adversos. Mais recentemente, o notável sucesso do mesilato de imatinibe no tratamento da leucemia mielógena crônica sugeriu que, em alguns casos, as células tumorais dependem de determinados oncogenes, como BCR-ABL, para a sua sobrevida. Este capí- tulo ressalta os princípios básicos da terapia do câncer dirigida contra alvos e fornece detalhes dos recentes avanços e tendên- cias para o futuro. MM. é uma mulher de 65 anos de idade, com câncer pulmonar de células não-pequenas metastático. Nunca fumou, e o tumor primário consiste em adenocarcinoma com características bronquio- alveolares. Foi inicialmente tratada com cisplatina e paclitaxel, porém o tumor está progredindo. Após discussão com o seu oncologista, MM. é tratada com o inibidor do receptor do fator de crescimento da epiderme (EGFR) oral, o erlotinibe. Embora desenvolva exan- tema cutâneo e diarréia com esse tratamento, a paciente tolera bem a medicação. São efetuadas tomografias computadorizadas para reestadiamento 2 meses após o início do tratamento com erlotinibe. Os exames revelam uma notável redução na carga tumo- ral, e depois de 6 meses M.W. não apresenta nenhuma evidência residual de câncer. A determinação da sequência do gene do EGFR de seu tumor primário revela uma mutação no domínio de cinase no códon 858, resultando em substituição da leucina por arginina (L858R). Infelizmente, MW. desenvolve subsequentemente resis- tência ao erotinibe e sofre recidiva da doença. A realização de nova biópsia revela uma nova mutação no domínio do EGFR cinase no códon 790 (T790M). Decide participar de um estudo clínico do HKt272, um inibidor irreversível do EGFR, que demonstrou ter atividade in vitro contra células de câncer pulmonar apresentando essa mutação. QUESTÕES E 1. De que maneira a sinalização através do EGFR promove o crescimento e a sobrevida das células? 656 | Capítulo Trinta e Oito E 2. Através de que mecanismo o erlotinibe inibe o EGFR e o crescimento de células cancerosas? Como poderiam ser selecionados subgrupos de pacientes para terapia efetiva dirigida contra alvos? Quais os mec nos responsáveis pela resistência à tera- pia dirigida para alvos e como essa resistência poderia ser superada? Es. Ea. BIOQUÍMICA DA TRANSDUÇÃO DE SINAIS INTERCELULARES E INTRACELULARES FATORES DE CRESCIMENTO E RECEPTORES DE FATORES DE CRESCIMENTO A estimulação do crescimento e da proliferação das células por sinais externos é mediada pela interação de fatores de crescimento com receptores específicos de superfície celular. Tipicamente, os receptores dos fatores de crescimento contêm um domínio extracelular de ligação do ligante, um domínio transmembrana hidrofóbico e uma cauda citoplasmática que possui atividade intrínseca de tirosinocinase ou uma proteína associada de tirosinocinase (Fig. 38.1A,B). Em geral, a ligação do fator de crescimento resulta em oligomerização do receptor, em mudança na conformação do domínio citoplasmático do receptor e em ativação da tirosinocinase. Subseqjientemente, os alvos intracelulares são fosforilados, propagando um sinal que culmina em progressão pelo ciclo celular e em proliferação celular. Exemplo de um receptor de tirosinocinase é o receptor do fator de crescimento da epiderme (EGFR), que possui ativi- dade intrínseca de tirosinocinase e que pertence à família ErbB mais ampla de proteínas, incluindo EGFR (ErbB1), HER-2/neu (ErbB2), ExbB3 e ErbB4. A ligação do fator de crescimento da epiderme (EGF) ou do fator transformador de crescimento a (TGF-a) a EGFR resulta em homodimerização do receptor e propagação de um sinal de crescimento. Além disso, pode ocorrer heterodimerização entre membros da família, produ- zindo maior diversidade no sinal transduzido. Os receptores ErbB são expressos nas células epiteliais e, com frequência, são ativados ou hiperexpressos numa variedade de carcinomas (por exemplo, o EGFR no câncer pulmonar de células não-pequenas e o HER-2/neu no câncer de mama). Outros exemplos de receptores de tirosinocinase incluem o receptor do fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGFR), o receptor do fator de crescimento dos fibroblastos (EGFR), o c-KIT e a tirosinocinase semelhante a FMS (FIT- 3). A sinalização através desses receptores ativa o crescimento de determinados tecidos hematopoéticos e mesenquimatosos, e observa-se freqiientemente uma desregulação desses recepto- res em distúrbios mieloproliferativos específicos, leucemias e sarcomas (Quadro 38.1). Outros receptores hematopoéticos dependem da interação com uma tirosinocinase citoplasmática associada para a trans- dução de um sinal de crescimento. Por exemplo, os receptores de citocinas tipo I, como o receptor de eritropoetina (EpoR), o receptor de trombopoetina (TpoR) e o receptor do G-CSF (GCSFR), formam homodímeros especificamente orientados com a ligação do ligante, resultando em ativação da tirosino- cinase associada a JAK2, levando a uma sinalização adicional e, por fim, ao crescimento da célula. A ocorrência de muta- ções ativadoras dos próprios receptores (por exemplo, EpoR) Ligante O —(porexemplo, EGP) . o Domínio de y y ligação A do ligante Domínio trans- membrana Domínio de tirosinocinase Atividade de tirosinocinase e Proteina O ligante alvo intracelular (por exemplo, EPO) Domínio de Y ligação do ligante Domínio trans- membrana Proteína tirosinócinase Atividade do —— inativa tirosinocinase am) (por exemplo, JAK2) D esa Proteína aivo intracelular Fig. 38.1 Estrutura e função dos receptores dos fatores de crescimento. A. Os receptores de fatores de crescimento, exemplificados pelo receptor do fator de crescimento da epiderme (EGF), contêm um domínio de ligação do ligante extracelular, um domínio transmembrana hidrofóbico e um domínio citoplasmático com atividade intrínseca de tirosinocinase. A ligação do ligante resulta em homodimerização do receptor (ou em heterodimerização no caso de outros membros da família), deflagrando a ativação da tirosinocinase, a autofosforilação do receptor e a fosfonilação de proteinas alvo intracelulares. B. Os receptores dos fatores de crescimento exemplificados pelos receptores de citocinas | (como o receptor de eritropoetina [EPO]) carecem de atividade intrínseca de tirosinocinase. Na verdade, esses receptores estão associados a proteinas intracelulares tirosinocinases, como JAK2. Com a dimetização do receptor induzida pelo ligante, a cinase associada é ativada e autofosforilada, resultando no recrutamento e na fosforilação de proteinas alvo intracelulares. foi implicada em determinadas afecções, como a policitemia congênita. Recentemente, foi constatada a ocorrência de uma mutação ativadora de JAK2, resultando em conversão da vali- na em fenilalanina na posição 617 (V617F) numa maioria de pacientes com o distúrbio mieloproliferativo policitemia vera em uma proporção significativa de pacientes com trombocite- mia essencial e metaplasia mielóide com mielofibrose. VIAS DE TRANSDUÇÃO DE SINAIS INTRACELULARES A ativação de um receptor de fator de crescimento dá início à transdução de uma série de sinais intracelulares, culminando em eventos como entrada no ciclo celular, promoção da tradução de proteínas e crescimento celular e aumento da sobrevida da célula. Duas grandes categorias de vias ativadas por tirosinoci- nases de receptores incluem a via da RAS-MAP cinase e a via da fosfatidilinositol-3-cinase (PIZK)-AKT (Fig. 38.2). (uaek]— — otimos, oo) 6) Giolina D) e emo o Y Genes da fase S Geres da fase S E2F VS Fase G1 Fases Fig. 38.3 Regulação da transição G1/S do ciclo celular. A ativação da MAP cinase resulta em aumento da expressão das ciclinas do tipo D. A cidina D liga-se a seus parceiros catalíticos, as cinases 4 e 6 ciclina-dependentes (CDK4 e CDK6), que fosforilam a proteína do retinoblastoma (RB). A fosforilação da RB libera a repressão transcricional que exerce nos genes da fase S, permitindo ao fator de transcrição E2F ativar a transcrição de genes necessários para a entrada na fase S. Esses genes incluem a ciclina E, bem como a DNA polimerase e as enzimas envolvidas na síntese de nucleotídios. A ciclina E liga-se a seu parceiro catalítico CDK2, que fosforila ainda mais a RB, criando uma alça de retroalimentação positiva que impulsiona as células na fase S (não ilustrada). O sistema CDK2/CDK4/CDK6 é contrabalançado por inibidores de cinases ciclina-dependentes (CDKI), como p16, que inibe CDK4/6, e p21 e p27, que inibem CDK2 (não ilustradas). complexados com dois íons Zn?* centrais. As E3 ligases podem ser subdivididas em RING E3 de subunidades simples e em complexos de múltiplas subunidades, como a família de pro- teínas Skp1-Cullin-F-box (SCF) de ligases E3. Nestes últimos 0 Etapa 1 | Etapa 2 pri D) AMP EM) e, “04 UM) “>Ubiguitina g F-Bortezomibe Proteassomo 268 A 0 '5) o Fragmentos de proteína alvo Lo Fig. 38.4 A via de ubiqui o 659 Farmacologia do Câncer: Transdução de Sinais | complexos, o componente em RING finger, Rbx, é distinto do componente de especificidade, a proteína F-box, assim deno- minada devido a um motivo característico identificado pela primeira vez na ciclina F. Uma vez seletivamente ubiquitinadas, as proteínas consti- tuem alvos para degradação pelo proteassomo 268, que consis- teem uma partícula cilíndrica encontrada tanto no citoplasma quanto no núcleo. A subunidade 208 central é o componente catalítico com múltiplos sítio s proteolíticos, enquanto o com- ponente regulatório 19S medeia a ligação de proteínas conju- gadas à ubiquitina e apresenta múltiplas ATPases envolvidas no desdobramento e liberação de substrato na câmara 208 central. Os substratos são clivados progressivamente, com degradação completa de uma proteína antes da entrada da próxima proteína. Segmentos peptídicos curtos, com comprimento médio de 6 a 10 aminoácidos, são expelidos e subsegiientemente hidrolisa- dos a seus aminoácidos componentes no citosol. A regulação da degradação de proteína ocorre, em grande parte, no nível da E3 ubiquitina ligase e governa aspectos essen - ciais do controle do ciclo celular, da apoptose e de outros pro- cessos celulares importantes (Fig. 38.4B). Por exemplo, a CBL é uma E3 ubiquitina ligase RING de uma única subunidade cujo alvo consiste em membros da família EGFR fosforilados para degradação. Além disso, tanto as ciclinas quanto os inibidores de cinase ciclina-dependentes constituem importantes alvos para degradação por proteassomo mediada pela ubiquitina. O complexo promotor de anáfase é um complexo de E3 ligase contendo RING multiproteína que é ativado por fosforilação tardia na mitose, desencadeando a degradação da ciclina B e a progressão através da mitose. A regulação da transição da E3 ligases RING de uma única subunidade las subunidades E) o) 0» 0 U Efe ) Ligase de uma única subunidade Alvo Proteína ligase F-box Alvo ceL EGFR Skp2 p27, FOXO MDM2 p53 Fbw7 Ciclina E priCP APC, IxBa. Ligase semelhante a SCF Alvo Complexo Ciclina B promotor de anáfase VHL HiF-ta. a-proteassomo. A, A ubiquitina (Ub) é ativada por conjugação ATP-dependente com E1, a primeira enzima da via. A seguir, a ubiquitina ativada passa do sítio ativo de cisteina da E1 para o sítio ativo de cisteína da enzima conjugadora de ubiquitina, E2, que atua de modo coordenado com a ligase da ubiquitina E3, fixando a ubiquitina a alvos protéicos. A poliubiquitinação de proteinas alvo resulta em seu reconhecimento pelo proteassomo 268, que consiste em uma subunidade regulatória externa 195 e em uma câmara central interna 205. O proteassomo medeia a degradação proteolítica da proteína alvo em fragmentos peptídicos curtos. O bortezomibe é um inibidor do proteassomo, que foi aprovado para uso no tratamento do mieloma múltiplo e que está em fase de investigação para uso em outras neoplasias malignas. B. A família RING de ubiquitina ligases E3 consiste em enzimas de uma única subunidade (à esquerda) e em complexos protéicos de múltiplas subunidades (à direita). As ligases de uma única subunidade incluem CBL, cujo alvo é o EGFR para degradação, e MDM2, cujo alvo é a p53 para degradação. Os complexos de ES ligase RING de múltiplas subunidades incluem membros da família de SCF e semelhante a SCF, assim denominados pelas suas subunidades Skp1, Cullin e proteina F-box. O componente protéico F-box medeia a especificidade da proteína-alvo; por exemplo, o alvo de SKP2 é a p27 e FOXO para degradação, o alvo de Fbw7 é a ciclina E para degradação, e o alvo de BCP é APC e IxBa: para degradação. Os complexos de ligase semelhante a SCF incluem o complexo promotor de anáfase, cujo alvo é a ciclina B para degradação, e VHL, cujo alvo é a subunidade a do fator induzível de hipoxia 1 (HiF-1a) para degradação. 660 | Capítulo Trinta e Oito fase GI-S é mediada, em parte, pelo inibidor de cinase ciclina- dependente p27, que inibe os complexos de ciclina E/CDK2 e de ciclina A/CDK2. A degradação de p27 é regulada por outra SCF E3 ligase, que se liga a p27 através de seu componente de especificidade F-box, Skp2. Por conseguinte, a hiperexpressão de Skp2, que é encontrado em diversos tipos de tumores, pode promover a progressão através do ciclo celular pela degradação de p27. A degradação de FOXO por Skp?2 constitui um segundo mecanismo pelo qual a hiperexpressão de Skp2 pode promover a tumorigênese. Outro complexo de SCF E3 ligase regula a ati- vidade da ciclina E, que serve de alvo para degradação através da proteína F-box, Fbw7. A perda da Fbw7 foi implicada na progressão de tumores, devido a níveis elevados de ciclina E. Outro exemplo de E3 ligase que desempenha um papel crí- tico na regulação da apoptose e do ciclo celular é a MDM?2, uma E3 ligase de RING finger de subunidade simples, cujo alvo é a p53 para degradação. A ativação da MDML está ligada ao comprometimento do processo de apoptose e à promoção da tumorigênese através da perda de p53. A MDM? também é inibida pela proteína p144%* que compartilha o mesmo locus genômico do inibidor CDK4/6, pl6. A ruptura desse locus, que constitui um dos eventos mais comuns no câncer, leva, em última análise, à inativação de p53 e pRB. Outras vias celulares essenciais reguladas pela degradação do proteassomo mediada pela ubiquitina incluem as vias de sinalização WNT e do fator nuclear capa B (NFkB). Ambas as vias constituem alvos para a proteína F-box comum, BTrCP, que reconhece substratos fosforilados (Fig. 38.5). A ativação da sinalização WNT impede a fosforilação da B-catenina, que permite o seu escape do reconhecimento por BTrCP e ligação da ubiquitina mediada por SCF E3, resultando em translocação da f3-catenina para o núcleo com sens parceiros TCFILEF e em ativação da transcrição de genes, como myc e ciclina D1. Essa via também é regulada pelo gene da polipose adenomatosa do colo (APC), que forma parte do complexo que promove a fosforilação e destruição subseqiiente da f-catenina. A perda do APC nas células colorretais impede a fosforilação da P-cate- nina, resultando em seu acúmulo e na promoção do câncer A proteína do F-box, BTrCP, também regula a sinalização através de NFKB, que é inibido pela sua associação com o inibidor de NFKB (IXB). A fosforilação do IxB pela IXB cinase permite a ligação da BTrCP e a ativação da destruição do IkB mediada pelo proteassomo. Essa liberação da atividade de IKB permite a translocação de NFKB para o núcleo e a ativação da transcrição de genes envolvidos na proliferação e inflamação. ANGIOGÊNESE Os tumores sólidos precisam desenvolver uma neovasculatura para sustentar o seu crescimento e sobreviver a condições de hipoxia. A angiogênese tumoral é um processo complexo envol- vendo diversos fatores pró-angiogênicos e antiangio gênicos distintos. A família do fator de crescimento endotelial vas- cular (VEGF) de proteínas e receptores emergiu como regu- lador-chave desse processo. A família do VEGF consiste em sete ligantes, incluindo o VEGF-A, -B, -C, -D, Ee o fator de crescimento da placenta (PIGF)-1 e -2 (Quadro 38.2). Esses ligantes possuem afinidades variáveis pelos principais recep- tores do VEGE, o VEGFRI (também conhecido como Fit-1), o VEGFR2 (FIk-1/KDR) e VEGFR3 (Flt-4). Os receptores do VEGF são receptores de tirosinocinases. As neuropilinas (NRP-1 e -2) são co-receptores que carecem de um domínio de sinalização intracelular e que potencializam a ligação do ligante ao VEGFRI e ao VEGFR2. O VEGFRI e o VEGFR? são expressos sobre o endotélio vascular e desempenham fun- ções essenciais na sinalização da angio gênese, enquanto a sina- lização através do VEGFR3 parece desempenhar um importante papel na linfangio gênese (isto é, desenvolvimento de novos vasos linfáticos). Foi constatado que o VEGFR?, que parece ser o principal receptor pró-angiogênico do VEGF-A, sinaliza através de uma via de RAF/MAP cinase para promover a pro- liferação das células endoteliais, bem como através de uma via PISK/AKT para promover a sobrevida das células endoteliais. O VEGF também induz poderosamente a permeabilidade vas- cular, utilizando vias de sinalização semelhantes para promover a formação de organelas vesiculares nas células transendoteliais e para abrir junções interendoteliais. A invasão e a migração das células endoteliais é promovida pela ativação de metalo- proteinases e serina proteases da matriz e pela reorganização da actina intracelular. A ativação do VEGF é mediada por determinados estimu- los, como hipoxia, citocinas e fatores de crescimento, e por uma variedade de oncogenes e genes supressores de tumor. A regulação da resposta à hipoxia é mediada pela proteína de von Hippel-Lindau (VHL), um componente de um complexo de E3 ubiquitina ligase RING semelhante a SCF, cujo alvo é o fator induzível por hipoxia la (HIF-la) para destruição (Fig. 38.6). A perda do VHL constitui o evento de definição na síndrome de VHL hereditária e constitui um achado freqiiente no carcinoma renal esporádico de células claras. Em condições de normoxia, o HIF-la sofre hidroxilação oxigênio-dependente, permitindo a ligação do VHL e a degra- dação subseqiiente mediada pela ubiquitina. Durante a hipo- xia, o VHL é incapaz de ligar-se ao HIF-la, permitindo a sua translocação para o núcleo e emparelhamento com seu parceiro de ligação HIF-1$, ativando a transcrição de genes induzíveis por hipoxia, como VEGF, PDGF-f e TGF-a. Dessa maneira, a angiogênese é estimulada por condições hipóxicas e pela ati- vação inapropriada do HIF-1, devido à perda da expressão do VHL nos tumores. As citocinas como a IL-1 e a IL-6, bem como as prosta- glandinas e a ativação da COX-2, também podem estimular a produção do VEGE Foi também constatado que a sinalização através de membros da família do EGFR, PDGFR e receptor do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1R) induz a expressão do VEGF Por fim, a ativação de onco genes, como RAS, SRC e BCR-ABL, e a inativação de genes supressores tumorais, como p53 e PTEN, podem resultar na produção do VEGF, promovendo, assim, a angio gênese e a manutenção do tumor. CLASSES E AGENTES FARMACOLÓGICOS ANTAGONISTAS DOS RECEPTORES DE FATORES DE CRESCIMENTO E DE TRANSDUÇÃO DE SINAIS A identificação de vias específicas que sofrem desregulação em certos tumores propicia o uso potencial de componentes- chave dessas vias como alvos, de uma maneira mais seletiva. Enquanto as vias dos fatores de crescimento e da transdução de sinais anteriormente descritas são ativas durante a fisiologia celular normal, alguns tumores podem tornar-se dependentes de determinada via para o seu crescimento e sobrevida. Por outro lado, nas células normais, a redundância das vias de sinalização proporciona uma compensação, exemplificada pela observação de que a inativação do gene EGFR no camundongo produz Farmacologia do Câncer: Transdução de Sinais | 661 Enrolado Ausência de Wnt Transcrição de genes que promovema À gama o N SAX co 6) Fragmentos de fr-catenina (O Ausência de estímulos Múltiplos estímulos BD (VA (5) (q “| Complexo inativo a Bos Transcrição de genes nvolvidos na proliferação na inflamação Fragmentos de IxB Fig. 38.5 Via de sinalização de WNT e via de NF«B. A. Na ausência de sinalização de WNT, a p-catenina é fosfotilada pelo complexo protéico da polipose adenomatosa do colo (AP). A p-catenina fosfotilada é reconhecida por BTICP e, dessa maneira, atua como alvo para degradação através do proteassomo mediado pela ubiquitina. A ativação da sinalização WNT inibe a função do APC, permitindo o acúmulo de p-catenina e sua translocação para o núcleo. No núcleo, a B-catenina forma um complexo com seus parceiros TCF/LEF e ativa a transcrição de genes que promovem a progressão do cido celular. A perda hereditária ou adquirida de APC permite o acúmulo de p-catenina, contribuindo para a oncogênese no câncer de cólon. B. De forma semelhante, a proteína |xB serve de alvo para degradação através do proteassomo mediado pela ubiquitina em consequência da fosforilação pela IxB cinase e reconhecimento pela BTCP, Na ausência de estímulos, IxB liga-se ao NF«B, inibindo-o. Na presença de estímulos, a degradação de IxB pelo proteassomo propicia a translocação do NFxB para o núdeo e a ativação da transcrição dos genes envolvidos na proliferação e inflamação. 664 | Capítulo Trinta e Oito derivado da 2-fenilaminopirimidina específico contra o PDGFR. Subsegilentemente, foi constatado ser o imatinibe um potente ini- bidor de ABL cinases, incluindo a proteína de fusão BCR-ABL gerada em consegiiência da translocação cromossômica t(9;22) (cromossomo Filadélfia) que ocorre na leucemia mielógena crônica (LMC), e verificou-se também que esse agente inibe o receptor de tirosinocinase CKIT. O mesilato de imatinibe é o exemplo canônico de um agente terapêutico com alvo especí. fico, visto que a BCR-ABL é exclusivamente expressa por células leucêmicas e é essencial para a sua sobrevida. Estudos iniciais realizados in vitro demonstraram que o mesilato de imatinibe inibe poderosamente e de modo espe- cífico o crescimento das células que expressam BCR-ABL. A avaliação subsegiiente de uma formulação oral em camun- dongos demonstrou uma supressão do crescimento de tumores humanos BCR-ABL -positivos, com efeitos adversos mínimos. Um estudo de fase I do mesilato de imatinibe em pacientes com LMC na fase crônica produziu resultados impressionan- tes, com normalização das contagens hematológicas (resposta hematológica) em 95% dos pacientes e redução significativa das células com cromossomo Filadélfia (resposta cito genética) em 41% dos pacientes. Em um estudo de fase III que compa- rou o mesilato de imatinibe com tratamento convencional com interferona e citarabina em pacientes com LMC na fase crôni- ca, o mesilato de imatinibe foi superior, com taxa de resposta hematológica de 95% e respostas citogenéticas completas em 76% dos pacientes. O tratamento da fase acelerada ou blástica da LMC com mesilato de imatinibe é menos efetivo, porém está associado a algumas respostas. O mesilato de imatinibe é relativamente bem tolerado, e seus principais efeitos adversos consistem em edema superficial, náusea, câibras musculares, exantema cutâneo e diarréia. Apesar das taxas impressionantes de resposta hematológica e cito genética na fase crônica da LMC, a avaliação dos produtos de transcrição de BCR-ABL residuais por PCR com transcrip- tase reversa (RT-PCR) revelou que apenas 39% dos pacientes apresentam uma resposta molecular completa, constituindo uma medida muito mais sensível das células leucêmicas resi duais. Os estudos preliminares sugerem que, em comparação com a dose padrão de 400 mg, o tratamento inicial com 800 mg de mesilato de imatinibe pode aumentar a fregiiência de respostas moleculares, porém à custa de uma maior freqiiên- cia de efeitos adversos; todavia, esses resultados estão sendo atualmente avaliados em um estudo randomizado. Em vista do desenvolvimento relativamente recente do mesilato de imatini- be, é necessário proceder a um acompanhamento a longo prazo para determinar a persistência dessas respostas obtidas com o transcorrer do tempo. A mutação do C-KIT, o receptor do fator de células-tronco (SCF), é observada fregiientemente nos tumores estromais gastrintestinais (TEGI) e no distúrbio mieloproliferativo, a mastocitose sistêmica. Nos TEGI, as mutações e as deleções in frame de CKIT são tipicamente encontradas no domínio justamembrana, resultando em ativação constitutiva da tirosi- nocinase na ausência de ligante. Por outro lado, na mastocitose sistêmica, a mutação ativador de C-KIT característica, D816V, encontra-se dentro do próprio domínio de cinase. Embora tenha sido constatada uma atividade siguificativa do mesilato de ima- tinibe nos tumores estromais gastrintestinais avançados, esse agente demonstrou ser, em grande parte, ineficaz no tratamento da mastocitose sistêmica, devido a uma atuação inefetiva sobre o alvo de C-KIT cinases com mutação D816V. A síndrome hipereosinofílica idiopática, bem como uma variante da mastocitose sistêmica com eosinofilia, caracteriza se pela expressão da proteína de fusão FIPLI-PDGERA, que é gerada por uma deleção cromossômica intersticial, resultando em sinalização constitutiva através de PDGFRA. A inibição de PDGFRA mediante tratamento com mesilato de imatinibe demonstrou ser uma abordagem terapêntica bem-sucedida em ambas as condições. Dasatinibe e Nilotinibe Os estudos cristalográficos realizados mostraram que o alvo do mesilato de imatinibe consiste no sítio de ligação de ABL ao ATP apenas quando a alça de ativação da cinase encontra-se fechada, estabilizando, assim, a proteína numa conformação inativa. Foi observado o desenvolvimento de resistência clíni- ca ao mesilato de imatinibe em alguns pacientes com LMC, algumas vezes devido a uma amplificação de BCR-ABL, porém mais freqiientemente devido à aquisição de mutações de resistência. Apenas uma fração dessas mutações interfere diretamente na ligação do fármaco, enquanto a maioria das mutações afeta a capacidade da ABL de adotar a conformação fechada à qual se liga o mesilato de imatinibe. Uma segunda classe de inibidores da tirosinocinase, os duplos inibidores SRC-ABL, pode ligar-se ao sítio de ligação do ATP da ABL, independentemente do estado de conformação da alça de ativação. Um desses fármacos, o dasatinibe (BMS- 354825), possui eficácia significativamente maior do que o mesilato de imatinibe contra BCR-ABL de tipo selvagem; além disso, inibe a atividade da maioria das isoformas de BCR-ABL clinicamente relevantes e resistentes ao mesilato de imatinibe, à exceção da mutação T3 151. Outra abordagem baseada na estrutura para melhorar a efi- cácia do mesilato de imatinibe tem sido substituir o grupo N- metilpiperazina por grupos de ligação alternativos, levando ao desenvolvimento do nilotinibe (AMN107). À semelhança do dasatinibe, a afinidade do nilotinibe pela BCR-ABL de tipo selvagem é significativamente maior que a do mesilato de ima- tinibe, e o nilotinibe inibe a maioria dos mutantes resistentes ao imatinibe, à exceção de T3151. Tanto o dasatinibe quanto o nilotinibe possuem atividade em pacientes com LMC que desenvolveram resistência ao mesilato de imatinibe, e ambos estão sendo objeto de testes clínicos adicionais. Ambos os fármacos também superam a resistência da mutação C-KIT D816V in vitro e estão sendo testados em pacientes com mas- tocitose sistêmica. Inibidores de FLT3 Uma das mutações mais comuns observada na leucemia mieló- gena aguda (LMA), que ocorre em cerca de 25 a 30% dos pacientes, envolve uma duplicação interna em série dentro do domínio justamembrana do receptor de tirosinocinase FLT3. Essa mutação resulta em dimerização independente do ligante e ativação da sinalização através das vias RAS/MAPK e STAT. Foram desenvolvidos vários inibidores de FLT3 que demons- tram uma atividade antileucêmica in vitro. Vários agentes experimentais, como PKC412, demonstraram atividade como agentes isolados em pacientes com recidiva da LMA ou com LMA refratária apresentando mutações de FLT3. Estão sendo realizados estudos para examinar se os inibidores de FLT3 podem melhorar o desfecho em associação com a quimiote- rapia convencional. Um desses agentes, PKC412, também é um potente inibidor da mutação de C-KIT e da mutação de resistência D$16V e também está sendo avaliado em pacientes com mastocitose sistêmica. Inibidores de JAK2 Apesar do sucesso do mesilato de imatinibe no tratamento da LM, a base genética dos outros distúrbios mieloprolifera- tivos principais (policitemia vera, trombocitemia essencial e metaplasia mielóide com mielofibrose) era, até recentemente, obscura. Hoje em dia, tornou-se evidente que uma mutação ati- vadora comum de JAK2 (V617F) está na base da sinalização e proliferação aberrantes na maioria dos casos, embora ainda não se tenha esclarecido como uma mutação pode levara esse espec- tro de distúrbios. A mutação V617F é observada no domínio de pseudocinase da JAK2, e a ruptura dessa região anto-inibitória leva a uma atividade não-controlada da cinase. As células que contêm a mutação JAK2 V61TF têm o seu crescimento inibido esofrem apoptose em resposta a inibidores específicos de JAK2 in vitro. Por conseguinte, estão sendo desenvolvidos inibidores de JAK2 para o tratamento da policitemia vera, da tromboci- temia essencial e da metaplasia mielóide com mielofibrose. Inibição da Via de RAS/MAP Cinase A mutação oncogênica de ras constitui um dos eventos mais comuns nos processos malignos, ocorrendo em cerca de 30% dos cânceres humanos. Com fregiiência, são observadas muta- ções de K-ras no câncer de pulmão de células não-pequenas, no câncer colorretal e no carcinoma pancreático, enquanto muta- ções H-ras são encontradas nos cânceres renais, de bexiga e da tireóide. Ocorrem mutações de N-ras no melanoma, no carci- noma hepatocelular e nas neoplasias malignas hematológicas. Todavia, apesar da fregiiência dessas mutações, a inibição da RAS tem sido, até o momento, difícil e só produziu sucesso clínico mínimo. Os esforços têm sido envidados, em sua maio- ria, no alvo de farnesilação da RAS e inibição dos efetores distais. A farnesilação da RAS é essencial para a sua associa- ção à membrana plasmática e ativação subseqiiente. Foram desenvolvidos diversos inibidores da farnesiltransferase (FTI) que inibem a farnesilação da RAS. Embora esses inibidores demonstrem uma atividade contra a RAS in vitro, algumas RAS mutantes exibem resistência, e existem numerosos outros alvos de farnesilação que poderiam ser inibidos pelos FTI, sendo provavelmente responsáveis pelos efeitos citotóxicos desses fármacos. Os FTI testados clinicamente incluem o tipifarni- be e o lonafarnibe. O tipifarnibe demonstrou ter atividade na LMA em recidiva/refratária, embora as respostas pareçam não depender de mutações do ras. Os testes clínicos dos FTI em tumores sólidos ainda não tiveram sucesso. Imediatamente abaixo da RAS, encontra-se a serina/treonina cinase RAF que fosforila MEK, que, por sua vez, fosforila a MAP cinase, levando à ativação de fatores de transcrição (Fig. 38.24). Existem três membros da família RAF A-RAF B-RAF e C-RAF Recentemente, foram detectadas mutações ativado - ras de B-RAF em uma proporção significativa de melanomas malignos, e a sua presença também é observada em menor fregiiência nos cânceres pulmonar, colorretal, ovariano e da tireóide. O sorafenibe foi inicialmente planejado como ini dor do CRAF, porém também demonstra uma elevada ati dade inibitória contra o B-RAF tanto do tipo selvagem quanto mutante. O sorafenibe demonstrou ter atividade significativa contra linhagens de células do melanoma que contêm muta- ções B-RAF ativadoras, e esse fármaco está sendo atualmente objeto de testes clínicos para uso no tratamento do melanoma. O sorafenibe também inibe a atividade de tirosinocinase do VEGFR-2 e PDGFR-f e possui eficácia clínica demonstrada no tratamento do carcinoma de células renais. Farmacologia do Câncer: Transdução de Sinais | Existem dois homólogos do MEK, o MEKI e o MEK2, ambos com dupla atividade de serina-treonina e tirosinocina- se, fosforilando e ativando ERKI e ERK2. O C1-1040 é um inibidor altamente ativo de MEKI e MEK2. Os testes clíni- cos iniciais com CI-1040 em pacientes com tumores sólidos demonstraram alguma atividade, porém com características far- macocinéticas desfavoráveis. Foram desenvolvidos inibidores de MEK de segunda geração mais potentes e biodisponíveis, que estão sendo submetidos a estudos clínicos. Um importante conceito emergente é a necessidade de iden- tificar subgrupos específicos de tunores sensíveis a agentes dirigidos contra alvos específicos, exemplificados pela sensi- bilidade do CPCNP com mutação do EGFR ao gefitinibe e ao erlotinibe. Uma abordagem atual consiste em identificar perfis de expressão gênica que sejam marcadores de ativação de oncogenes. Por exemplo, um perfil de expressão gênica espe- cífico foi caracterizado para ativação de RAS, e esse perfil correlaciona-se com a mutação de RAS e a ativação da via RAS em linhagens celulares e amostras de tumores. Apenas as linhagens celulares que exibem perfis de expressão gênica em concordância com a ativação de RAS respondem aos FTI in vitro. Por conseguinte, a seleção de pacientes para estudos clínicos com base nessa abordagem pode enriquecer a atividade clínica de certos agentes como os FTI. Outra abordagem tem sido a identificação de subgrupos de perfis de ativação da via RAS capazes de prever uma responsividade à inibição distal de determinados alvos, como MEK. A comparação de linhagens celulares com mutações de N-RAS ativadoras com linhagens celulares que apresentam mutações de B-RAF ativadoras mos- trou que apenas estas últimas linhagens celulares exibem uma alta sensibilidade ao inibidor de MEK, CI-1040, possivelmente pelo fato de o MEK ser mais imediatamente distal ao RAF Por conseguinte, a seleção de pacientes com tumores que con- têm mutações de B-RAF para estudos clínicos de inibidores de MEK tem o potencial de produzir uma maior eficácia. Inibidores do mTOR A sinalização através da via PISK/AKT leva à ativação distal do alvo da rapamicina de mamífero (mTOR). O mTOR é uma serina-treonina cinase que regula múltiplas funções celulares, incluindo o crescimento e a proliferação das células, através de ativação da tradução. A regulação do mTOR é efetuada, em parte, por ativação da proteína Só cinase (p705%) do ribossomo 408 e inativação da proteína de ligação de 4E (4E-BPI) que regula a tradução de certos mRNA. Observa-se uma atividade desregulada do mTOR em uma ampla variedade de neoplasias malignas nas quais a via de PI3K é ativada ou a PTEN é per- dida. Além disso, síndromes de hamartoma, como a esclerose tuberosa, resultam em ativação do mTOR. O complexo protéico da esclerose múltipla (TSC1/2) atua como intermediário entre AKT e mTOR: a TSCI/2 nativa inibe o mTOR, e a ativação de AKT resulta em fosforilação de TSC1/2 e desrepressão sub- segiiente do mTOR. O TOR foi originalmente identificado através de triagem à procura de mutações em leveduras que conferiam resistência à rapamicina, e, subsegiientemente, foi descoberto o mTOR como o seu homólogo em mamíferos. A rapamicina (também conhecida como sirolimo) liga-se à FKBP12, um membro da família de proteínas de ligação de FK506, e o complexo rapa- micina-FKBPI2 liga-se ao mTOR, inibindo a sua atividade. Além de suas propriedades imunossupressoras, a rapamicina promove a inibição do ciclo celular, a apoptose e a inibição da angiogênese ao bloquear a tradução de alvos distais do mTOR, 666 | Capítulo Trinta e Oito como a cielina DI, c-MYC, a proteína antiapoptótica BAD e o HIF-lo. Na atualidade, diversos derivados da rapamicina estão sendo submetidos a testes clínicos numa ampla variedade de neoplasias malignas, incluindo o tensirolimo (CCI-779) e o everolimo (RADO01). Ambos são ésteres solúveis análogos da rapamicina, que exercem inibição dependente da dose sobre o crescimento das células tumorais in vitro. O tensirolimo forne- ceu evidências de atividade em vários estudos clínicos de fase II no carcinoma de células renais, no câncer de mama e no linfoma não-Hodgkin de células do manto. Os efeitos tóxicos observados incluíram exantema cutâneo, mucosite, tromboci- topenia e leucopenia. É provável que determinados subgrupos de pacientes sejam beneficiados pelos inibidores do mTOR, e os futuros estudos clínicos deverão ser planejados de acordo. Por exemplo, no carcinoma de células renais, foi constatado que a ativação do HIF-la, devido à perda da expressão de VHL, sensibiliza as células à inibição pelo mTOR, podendo explicar a atividade clínica do tensirolimo em um subgrupo de pacientes. Os pacien- tes com glioblastoma e perda de PTEN podem ser particu- larmente responsivos à inibição do mTOR, devido à ativação da via PIZK/AKT nessa neoplasia maligna. Além disso, como a sinalização do EGFR também depende dessa via, a terapia de combinação utilizando inibidores do EGFR e inibidores do mTOR está sendo explorada. INIBIDORES DO PROTEASSOMO Tendo em vista o papel da degradação pelo proteassomo medi- ado pela ubiquitina na regulação do ciclo celular, na apoptose e em vários ontros processos envolvidos na transformação neoplásica, foram testados inibidores do proteassomo tanto in vitro quanto in vivo para seus efeitos antitumorais. A pequena molécula bortezomibe, um dipeptídio com um componente boronato ligado, possui alta afinidade e especificidade con- tra um alvo de resíduo de treonina N-terminal ativo dentro da subunidade catalítica 208 do proteassomo (Fig. 38.44). Oborte- zomibe induz a inibição do crescimento e a apoptose das células tumorais, com relativamente poucos efeitos tóxicos sobre as células normais. Clinicamente, os efeitos do bortezomibe são reversíveis, exigindo a administração de doses intravenosas duas vezes por semana. O bortezomibe possui acentuada eficácia in vitro contra linhagens celulares derivadas do mieloma múltiplo, do linfoma, da leucemia linfocítica crônica, do câncer de cabeça e pescoço, do câncer de próstata e de uma variedade de outros tumores sólidos. O bortezomibe também demonstrou ter considerável eficácia em estudos clínicos de pacientes com mieloma múlti- plo em recidiva ou refratário, com taxa de resposta global de 35% e taxa de resposta completa de 10% em um estudo de fase Il e com taxas de resposta e sobrevida superiores em compara- ção com a terapia glicocorticóide padrão em um estudo de fase HI. Os principais efeitos adversos consistem em neuropatia, trombocitopenia e neutropenia. Com base nesses resultados, o bortezomibe foi aprovado para o tratamento do mieloma múl- tiplo refratário. Em virtude de sen perfil relativamente modesto de efeitos adversos, o bortezomibe também foi incorporado em esquemas de combinação para terapia primária do micloma múltiplo, produzindo algumas das taxas mais altas de resposta registradas até hoje nessa doença. Além disso, o bortezomibe está sendo testado como única medicação e em associação com quimioterapia convencional em uma ampla variedade de ontras neoplasias malignas. Foram propostos diversos mecanismos para explicar a eficá- cia do bortezomibe no mieloma múltiplo. Um desses mecanis- mos envolve a inibição do NFkB através da utilização de IkB (Fig. 38.5B). Como o NFkB ativa a transcrição de genes que promovem a proliferação celular e que bloqueiam a apoptose em resposta à inflamação e a ontros estímulos, seria de esperar que o antagonismo dessas ações pelo bortezomibe resultasse em inibição do crescimento e apoptose. Um segundo mecanis- mo proposto envolve o acúmulo de proteínas com dobramento incorreto, levando à morte celular. A exemplo dos plasmócitos a partir dos quais se originam, as células do mieloma múltiplo sintetizam grandes quantidades de imunoglobulinas. O prote- assomo pode desempenhar um importante papel na degrada- ção de proteínas com dobramento incorreto nessas células, e a inibição da função do proteassomo pelo bortezomibe pode ser fatal nessa situação. Foi também sugerido que o bortezomibe pode resultar em estabilização de inibidores de CDK e da p53. Com efeito, a mutação de p53 está associada ao desenvolvimen- to de resistência ao bortezomibe. Um segundo mecanismo de resistência ao bortezomibe envolve um aumento na expressão da proteína do choque térmico 27 (HSP-27), e estão sendo desenvolvidas abordagens visando à inibição das proteínas do choque térmico para superar a resistência ao bortezomibe e aumentar a sua eficácia. INIBIDORES DA ANGIOGÊNESE O reconhecimento do papel primário no VEGF e de seus recep- tores na regulação da angiogênese levou ao desenvolvimento de estratégias para bloquear a função do VEGF como maneira de romper a vasculatura tumoral. Até o momento, as abordagens mais bem-sucedidas incluem o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes contra o VEGF ou o VEGFR e pequenas molécu- las inibidoras do domínio de tirosinocinase do VEGER. Anticorpos Anti-VEGF O bevacizumabe é um anticorpo IgGl monoclonal murino humanizado recombinante, dirigido contra o VEGF-A, um dos principais membros pró-angio gênicos da família do VEGF. Em modelos murinos, o bloqueio do VEGF com um anticorpo monoclonal inibe a angio gênese e o crescimento de xenoenxer- tos de tumores humanos. Os estudos clínicos preliminares foram planejados para testar a eficácia do bevacizumabe no carcinoma de células renais metastático, visto que a maioria desses cânceres hiperexpressa o VEGF em consegiiência da perda de VHL e ativação do HIF-1. O tratamento de pacientes com carcinoma de células renais refratário com bevacizumabe como único agente resultou em melhora significativa da sobre- vida sem progressão da neoplasia, embora a taxa de resposta tenha sido de apenas 10%. A incorporação do bevacizumabe em esquemas de quimio- terapia padrão produziu maior sucesso em diversos tipos de tumores. A adição do bevacizumabe à quimioterapia para o câncer de colo metastático produziu uma melhora significativa nas taxas de resposta e na sobrevida mediana de aproximada- mente 15 a 20 meses. Foi também constatada uma melhora da sobrevida mediana em consegiiência da adição do bevacizu- mabe à carboplatina e ao paclitaxel no tratamento do CPCNP, embora pacientes com metástases cerebrais, histologia de célu- las escamosas e tumores centrais tenham sido excluídos desses estudos, visto que a ocorrência de sangramento intratumoral poderia resultar em hemorragia cerebral potencialmente fatal ou hemoptise grave. Foram também observados benefícios no (omuguo)) (opóvBisasur ap asey uto) aquisegeuor (opóviisasur ap asey wo) aqueregdi empregar emprosr mo (VINTD) vpnde oprojonu ermoono] va epensuomop apeprane inssod oquuegdy O vonpuised eeiquam v tred SVY ep Oman 0 9 SVY ep ordepsoney v exed ojuenodi 9 onb oseiajsuenpisomey e moquy oosfjoadso oommanf 14 — omstuoojy SISYNID dVIN/SVY SVIA SVA SINOGISINI Farmacologia do Câncer: Transdução de Sinais ovsvane ap vóje ep ovseunojnoo ap oprisa op sjnousjnapuadopm “Ty va AIY Op ovse3t] ap omIs oe vã] as onb 'asemo TAV-DNS EP Jopiquui ojdap um 9 aqunesep O ISTEI otdWnm ep ováooxo moo “oque ap oregrsow (opóviisasur or Samaisisos TAV-NOM SP Senuojost maq 2 osua 1 woJeajas odn op TIV-NOM ento aquaneim ap orisam o anb op viotorjo Jorem tonssod aquno|tu 09 squnesepO ap asey ua) aqunorix soanemae ovvi!] ap soda vred emzeadidinaw-N odu3 o imnsqus aqunogta O (oxóviisasur 9P 2Sej tua) aquimesed, orsei sonom vononoõon a voriojoteuay esodsas eum as-easasgo OjtouIAjostoSap wo tjSa 'oqumnzmsen o oo orsereduos wo TNEH op sinosogp odondo un v v3iy as onb “oquunzmsad O ap oejIsom oe opepiprqisuasiadir “opssosdnssojouu “muapg vonpdorpr vo) omisoaradig amospas eum to (TAV-NOM SP Omomtosredesop) senosjow wsodsor emamexo — oamsod (LIID) UM Oo (DAT) emn as-enIosgo ivorugro ae) vm INT 100 Sajuotovd op ovôeiy “uanrerp 'Soregnosnu sexqreo “easnvN Tensaunseã pemonso sownj, apueiã vma tuo (USPetg omossomor op onoutsaredesop) aquunem apoproixosodoy — oamsod viopeItj ourossomoso oo (OND votugão aprojomu emuconaT aqrunera ap ojeIsaIN WIDAd 9 LIN-D CIAVAOA OPSNÊ2p DiWoJoad D opumprs) sosputo TV DUNOS SDAyD osDIponISOLy Op sDao pique sejmojow souonhog — omstunoojy WaDAd 3 LDI-D “18V-HD8 JA SINOAISINI EPP UEL TE LA] eo) VAIpioar ap Sexty se znpai o videragoruab vp viovorjo 2 viadoono) umone eouud (oxóviisasur estate ajuvanípe oIxajnoo ou oquiunzmsen mos our O squiunzanod no aquunzmsen proustona mruoumoud TNHH ºP op osey uto) aquumznssog (THE) TAVA ennoo srenojoonow sodioonny or opepiqisuesiadre Doyosfou omospms opoproixogopao — orssardxerodry mos wurem ap 1o9nv5) aquumensexg, teroum visOdsar 9p [ents um 999n10] EIS) UxO Op Ojuomr Ajoanasap O oo “ernoyse Jens junseê orqumstp envosonu oo opemquios opuenb ao emuasonZemodiq “manreip emojneg essardxo onb puanojos 190nvo ou tjsodsa: ap exe) 1oMIN opôoofiu “uoupnd mjoquo proussorm (Tag) voa 4Duowpd vônoop “pouoa mouaronfiusu o500sad a váaquo ap 1s0nv5) op Jenposenxo orumuop oe vB as onb penojoonow odioonay aquurtmoo or apeprytqisuasiadrry “miuadoono| “vompavo npoava Iejenojos somo aquando omounajonnasop onIeIp “emojuexa ap asey tuo So “TAQUI O NEDEI OP Joprquar un “oquunedey O agumado “ogragunfuoo aquintjsã o mos opereduos oprenb 1oreu amourvonsteiso “pagouso mjnosva opuoproo 'spongpdoy epiadIgoS ap otorjanaq tn enasode aqrunopo O souzuo smp opônaajo “voypdorSunosouu asemo ap ormmop or dy Doupontom mutouo “opunfosd svaronvd op emomors (oxóviisasur op ovsvãt v mos ajadunos “(TEQL) NHDE Op asentoomsom ap squunedy no DSouDa asoquosy “pouso ur aiso8 senonbod ap asey wa) aqunedeT oompnIseIdono otummop Op [PaISIa 491 JOpIquar wm 9 Squnogo O — aqunonão oe apepiprqisuasiadiry mBvisowou “opanootu op ounfur “ora Sejnjgo op senomjnd so0nv5 aqunoHa Sargosajeoonorq seujso ap emontareo oo Sajuatovd mo |antiosey srem vjsodsay asemo op roneip “emojuexa olmuop oe ATy Op ovávit v mos sjaduoo (TAI) NOM OP pouso pp senonbod oompuIseIdono asemoom sam ap otummop Op [AISIdASI JOPIQuI aquunto3 or apeprmqusuasadg opsos jproussru «uowpd vônoog “ora Sejnjgo op senomjnd so0nv5 aqungoo onfisadso oopuunf 404 SnoujcHAH ? 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