PROCESSOS FERMENTATIVOS DOS MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia Parte1, Notas de estudo de Biotecnologia

Baixe PROCESSOS FERMENTATIVOS DOS MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia Parte1 e outras Notas de estudo em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity! UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROCESSOS FERMENTATIVOS Trabalho acadêmico apresentado à disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paraná ministrada. CURITIBA 2008 1 SUMÁRIO 1- USO DE MICRORGANISMOS NA FERMENTAÇÃO.................................... 2 2- DEFINIÇÃO DE FERMENTAÇÃO.................................................................. 8 3- METABOLISMO MICROBIOLÓGICO............................................................ 10 3.1- FERMENTAÇÃO ETANÓLICA................................................................. 15 3.2- FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO................................................... 19 3.3- FERMENTAÇÃO DO GLICEROL............................................................ 20 3.4- FERMENTAÇÃO ACETONA-BUTANÓLICA........................................... 22 3.5- FERMENTAÇÃO BUTANOL-ISOPROPANÓLICA................................... 24 3.6- FERMENTAÇÃO ACETONA-ETANÓLICA.............................................. 25 3.7- FERMENTAÇÃO DO ÁCIDO PROPIÔNICO........................................... 26 3.8- FERMENTAÇÃO DO ÁCIDO CÍTRICO................................................... 27 4- CULTIVO DE CÉLULAS MICROBIANAS...................................................... 28 4.1- BACTÉRIAS............................................................................................. 28 4.2- FUNGOS.................................................................................................. 29 4.3- LEVEDURAS............................................................................................ 29 5- CULTIVO DE CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS.......................................... 31 6- APLICAÇÕES DA FERMENTAÇÃO.............................................................. 35 6.1- PRODUÇÃO DE ALIMENTOS................................................................. 36 6.2- PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS............................................................ 39 6.3- PRODUÇÃO DE ENZIMAS...................................................................... 40 6.4- PRODUÇÃO DE ANTICORPOS.............................................................. 40 6.5- PRODUÇÃO DE INOCULANTES............................................................ 41 6.6- TRATAMENTO AMBIENTAL................................................................... 42 6.7- PRODUTOS RECOMBINANTES............................................................. 43 7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 46 8- ANEXO............................................................................................................ 49 4 Tabela 1- Produtos de origem fermentativa Produto da fermentação Microrganismo Aplicação Etanol (não utilizado em bebidas) Saccharomyces cerevisiae Química fina Ácido 2-cetoglucônico Pseudomonas sp. Intermediário para o ácido D- araboascórbico Pectinase, protease Aspergillus niger, A. aureus Agente clarificante em sucos de frutas Amilase bacteriana Bacillus subtilis Amido modificado, tratamento de papel Protease bacteriana B. subtillis Tratamento de fibras, removedor manchas Dextrano Leuconostoc mesenteroides Estabilizante alimentício Sorbose Gluconobacter suboxydans Manufatura de ácido ascórbico Cobalamina (vitamina B12) Streptomyces olivaceus Suplemento alimentar Ácido Glutâmico Brevibacterium sp. Aditivo alimentar Ácido glucônico Aspergillus niger Produtos farmacêuticos Ácido Lático Rhizopus oryzae Alimentos e produtos farmacêuticos Ácido cítrico Aspergillus niger, A. wentii Alimentos, medicamentos Acetona-butanol Clostridium acetobutylicum Solventes, intermediários químicos Insulina, interferon E. coli recombinante Terapia humana Início de cultura Levedura de pão, Lactobacillus bulgaricus Produção de pães, queijo e iogurte Proteína microbiana Candida utilis Suplemento alimentar Penicilina Penicillium chrysogenum Antibióticos Cefalosporina Cephalosparium ecremonium Antibióticos Eritromicina Streptomyces erythreus Antibióticos Fonte: NAJAFPOUR, 2007 Os microrganismos utilizam uma fonte orgânica e produzem metabólitos primários como o etanol, que são formados durante a fase de crescimento exponencial, ao mesmo tempo em que as novas células são produzidas, e a curva de produção do metabólito segue a curva de crescimento celular quase que paralelo, como mostra o gráfico esquerdo da figura 1. Outros produtos como a penicilina e polissacarídeos são considerados metabólitos secundários, sendo produzidos durante a fase estacionária. A fase de crescimento exponencial anterior a produção de metabólitos secundários é camada de trofofase, e a etapa estacionária em que há produção é chamada de idiofase, como mostra o gráfico da direita da figura 1. 5 Um metabólito secundário pode ser a simples conversão de um metabólito primário ou também pode ser originado de outros compostos, mas pode necessitar uma quantidade suficiente de células ou metabólitos primários acumulados (NAJAFPOUR, 2007; TORTORA et al., 2006). Figura 1- Metabólito primário e secundário. Fonte: TORTORA et al., 2006. Os bioprocessos vêm substituindo uma série de processos que antigamente só podiam ser feitos quimicamente. Eles apresentam algumas vantagens como a possibilidade de utilizar matéria-prima barata e disponível no mercado (como por exemplo, o bagaço de cana), o processo pode ser desenvolvido sob pressões e temperaturas normais (evitando sistemas pressurizados caros e perigosos), e não há a produção em quantidade de resíduos tóxicos (e quando há a produção, ainda existe a possibilidade de utilizar um outro processo microbiológico no tratamento do resíduo). (TORTORA et al., 2006) Os processos desenvolvidos no cultivo de microrganismos se desenvolvem geralmente em equipamentos denominados biorreatores. Eles consistem em um sistema aberto ou fechado, onde há a manipulação dos parâmetros físicos (pH, concentração de reagentes, transferência de calor e massa, aeração) de forma a regular a catálise, promovendo um melhor rendimento em biomassa e/ou produto, além de tentar minimizar os custos de produção (PURICH & ALLISON, 2000). Eles 6 geralmente são tanques cilíndricos que apresentam ou não sistema de agitação, mas também podem ser um simples erlenmeyer. Novos modelos de biorreatores aparecem constantemente, de forma a melhorar a qualidade do processo dependendo do tipo de célula a ser cultivada (bactérias, fungos, tecidos animais ou vegetais, células ou enzimas imobilizadas, etc.) (DORAN, 1995). Ao se utilizar um biorreator, procura-se atender, se não todos, a maioria dos requisitos listados abaixo:  O recipiente onde ocorrerá o cultivo deverá permanecer em condições assépticas durante um grande período de tempo.  Devem ser promovidas condições adequadas de agitação e areação para satisfazer as condições metabólicas dos microrganismos, mas sem haver danificação mecânica das células dos mesmos devido ao processo.  O consumo de energia deve ser minimizado.  Deve haver um controle de temperatura e pH.  Deve haver uma forma de retirar amostras do fermentado para o controle do processo.  Não deve haver perdas excessivas devido à evaporação.  Não deve haver a necessidade de uma grande quantidade de trabalhadores para a sua operação, limpeza e manutenção do tanque de fermentação, minimizando assim os custos com relação à mão-de-obra.  Materiais mais baratos, mas que ainda propiciam um rendimento desejado, devem ser utilizados. (STANBURY et al.,1995) O cultivo dos microrganismos pode ocorrer em diferentes tamanhos, como em escala de bancada, piloto ou de planta industrial. Biorreatores de escala laboratorial variam de 2 à 100 litros, mas durante operações em larga escala na indústria eles podem chegar a 100000 litros. Inicialmente utiliza-se biorreatores menores para se investigar qual é o melhor microrganismo a ser utilizado, qual meio de cultivo proporcionará um melhor crescimento e quais condições operacionais são mais favoráveis para a formação do produto desejado. São feitos estudos sobre parâmetros como: transferência de massa, agitação, taxa de cisalhamento, formação de espuma, energia necessária, taxa de diluição, forma e tamanho do biorreator, pH, temperatura, entre outros. Isso 9 significa qualquer processo de cultivo microbiológico que ocorre com ou sem ar. O significado bioquímico da fermentação é o processo metabólico onde o substrato orgânico atua como doador e como receptor final de elétrons, ocorrendo em condições anaeróbias, mas sem a utilização de uma cadeia respiratória, como acontece na respiração anaeróbia. (TORTORA et al., 2006) O termo “fermentador” também pode gerar alguma discordância devido a esses conceitos. Ele primeiramente foi utilizado para descrever os tanques onde ocorria o cultivo. Como a maioria dos cultivos realizados nesses tanques era de forma aeróbica, propôs-se um novo nome para não contradizer a definição bioquímica de fermentação. O termo “biorreator” então começou a ser usado para descrever o local onde eram realizados cultivos de microrganismos em condições aeróbicas e anaeróbicas (NAJAFPOUR, 2007). A fermentação ocorre como uma forma de reoxidar as coenzimas reduzidas NADH e NADPH que são formados durante a glicólise, de forma a manter o balanço de redução-oxidação dentro da célula. Os elétrons são transferidos das coenzimas para um composto orgânico, fornecendo NAD+ e NADP+ suficientes para a continuação da glicólise. (TORTORA et al., 2006) Durante uma fermentação, um mesmo composto orgânico pode sofrer uma oxidação ou outras a redução dependendo do microrganismo. Por exemplo, no caso do ácido pirúvico, ele pode sofrer uma oxidação formando ácido acético ou pode sofrer uma redução e formar ácido láctico. (CROCOMO, 1967) O tipo de fermentação realizada vai depender da espécie de microrganismo utilizada, do substrato que está sendo fornecido e dos tipos de enzimas que ele possui e estão ativas. A análise do tipo de produto final formado na fermentação também pode ser utilizada como forma de identificação de microrganismos, realizando testes bioquímicos. A figura 3 mostra o tipo de fermentação que segue alguns microrganismos. 10 Figura 3 – Produtos finais de fermentação dependendo do microrganismo Fonte: TORTORA et al., 2006 3- METABOLISMO MICROBIOLÓGICO Antes do processo metabólico que inclui a fermentação, há as reações de quebra do substrato, que geralmente é a glucose. Essa via recebe o nome de “glicólise” ou via de Embden-Meyerhof, onde a glucose é catabolisada a piruvato e a energia livre liberada é estocada na forma de ATP e NADH. Figura 4- Glicólise Glucose [> ADP D Glucose 6-phasphate q Fase Preparatória (1) Hexoquinase (2) Fosfoexose isomerase Fructose 6-phosphate (BHo-cH, 0. CH OH Hs (8) Fosfofrutoquinase-1 H E |*> ADP (4) Aldolase Fructose 1,8-bisphosphate (Bro-cH, cH—o-P) H HO (5) Triose fosfato H isomerase H A Glyceraldehyde 3-phosphate Beocomqa + N H E Dihydroxyacetone phosphate | a & | / Fase de Pagamento Glyceraldehyde 3-phosphate (2) 2P, 2NAD* [2 GDA) em 1,3-Bisphosphoglyeerate (2) |- 24DP |» 26) 3-Phosphoglyeerate (2) & 2-Phosphoglyeerate (2) > 2H,0 Phosphoenolpyruvate (2) 2ADP : "8 Pyruvate (2) Fonte: LEHNINGER et al., 2006 Bro que H A Bro-crt=cu=c H Pp Broca, can E q o Cam] mó o (E) Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (7) Fosfoglicerato quinase E Fosfoglicerato mutase (7) Enolase do Piruvato quinase  14 Depois de ocorrida a transformação de glucose até piruvato, em condições aeróbias ocorrerá o ciclo de Krebs, como mostra a Figura 6. Mas como se pode observar, esse ciclo de reações gera muitos NADH os quais seguem para a cadeia respiratória e há a transferência de elétrons, onde o aceptor final é o oxigênio. No entanto, em condições de anaerobiose, a célula não conseguirá manter o balanço adequado de NAD+/NADH, pois não poderá utilizar essa cadeia. Figura 6: Ciclo de Krebs (ou ciclo do ácido cítrico) Fonte: LEHNINGER et al., 2006 15 Portanto, em condições anaeróbias evita-se o ciclo do ácido cítrico (exceto nos casos de produção de metabólitos para biossíntese), e utiliza-se as vias fermentativas, as quais, apesar de não gerar tantas moléculas de ATP como o ciclo de ácido cítrico, conseguem reoxidar NADH suficientemente para manter o funcionamento celular. A Figura 7 mostra algumas das possíveis vias de fermentação. Figura 7- Vias Fermentativas * Reações em que há reoxidação de NADH Fonte: RATLEDGE & KRISTIANSEN, 2001 A seguir serão discutidas em maiores detalhes algumas dessas fermentações. 3.1- FERMENTAÇÃO ETANÓLICA É possível obter etanol de três formas: por via destilatória, por via sintética (a partir de hidrocarbonetos não saturados e de gases de petróleo e da hulha) e por via fermentativa. A forma fermentativa é uma das mais vantajosas aqui no Brasil, pois há uma grande disponibilidade de matéria-prima (LIMA et al., 2001). 16 O processo reacional do etanol já começou a ser descrito em 1815 por Gay Lussac através da equação: C6H12O6  2 CH3CH2OH + 2 CO2 ∆G=-56000 cal/mol (CROCOMO, 1967) O francês Luis Pasteur provou que a natureza dessa reação é microbiana, e se realiza através de uma fermentação em condições anaeróbias (LIMA et al., 2001). Ele observou que a presença de O2 no meio inibia a formação de etanol, diminuindo o consumo de açúcar pela levedura e aumentando o crescimento celular. Essa propriedade foi chamada de Efeito Pasteur. (CROCOCOMO, 1967) No entanto, o efeito Pasteur é somente observado em culturas quimioestáticas quando a concentração de substrato limita o crescimento ou quando o cultivo é feito na ausência de fontes de nitrogênio (LAGUNAS et al., 1982). Lagunas e colaboradores fizeram experimentos aeróbicos e observaram que S. cerevisiae cultivada na presença de fonte de nitrogênio usava somente 3 a 20% do açúcar metabolizado para respiração, o restante ia para a via fermentativa do etanol. Já leveduras cultivadas em meios sem nitrogênio utilizavam 25 a 100% dos açúcares metabolizados para respiração. No entanto, isso não significava que ouve um aumento da respiração, mas sim uma perda da função fermentativa devido à inativação dos sistemas de transporte de açúcares (LAGUNAS et al., 1982). Com o avanço dos estudos, foram elucidados os mecanismos reacionais intermediários da produção de etanol a partir de glucose. Até a formação de piruvato a reação segue exatamente igual a glicólise. O ácido pirúvico formado é descarboxilado a acetaldeído e dióxido de carbono. Essa etapa da reação é um processo irreversível que exige a presença da enzima carboxilase, da coenzima difosfato de tiamina e de íons magnésio. O acetaldeído é então reduzido a etanol através da ação da enzima desidrogenase alcoólica, ocorrendo também nessa etapa a reoxidação de um NADH (Figura 8). O conjunto de reações que resultam na formação de álcool etílico e CO2 à partir de um carboidrato recebe o nome de via de Embden-Meyer-Parnas. Essa via metabólica foi demonstrada in vitro pela primeira vez em 1950 por Koshland e Westheimer, utilizando glucose com carbono marcado radiativamente em C1, e após o seu consumo por leveduras, verificou-se que havia carbono radioativo na molécula de etanol, mais especificamente nodo grupo metil (CROCOMO, 1967). 19 3.2- FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO O ácido lático foi isolado pela primeira vez a partir do leite azedo por Scheele. Pasteur também realizou estudos com relação à fermentação láctica. Ele observou que assim como é sempre encontrada levedura na produção de cerveja, onde o fermento promove a conversão de açúcares em álcool e dióxido de carbono, deve haver um fermento que produza ácido láctico - a levedura láctica - convertendo açúcares em lactato. Ele também verificou que nessa fermentação o produto principal é o ácido láctico, mas também é possível encontrar no caldo fermentado outros produtos como ácido butírico, álcool e manitol, sendo que suas proporções podem variar (PASTEUR, 1857). Evitar essas outras vias e direcionar os compostos de carbono somente para a produção de lactato é uma forma de otimizar a sua produção. Figura 10- L-lactato a partir de piruvato Fonte: LEHNINGER et al., 2006 O ácido lático pode ser produzido através da fermentação de bactérias como os bactérias homofermentativos (Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus, L. pentosus, L. casei, L. leichmannii, Streptococcus lactis), de fungos como leveduras e ficomicetos, e também de algumas algas. Ele também pode ser produzido de forma sintética, através da hidrólise da lactonitrila (LIMA et al., 2001). O ácido lático pode apresentar duas formas esterioquímicas, devido ao carbono quiral presente. Durante a fermentação são formadas as duas formas, formando uma mistura racêmica (PRESCOTT et al, 1959). A fermentação ocorre em temperaturas relativamente altas e dependerá do microrganismo utilizado. Lactobacillus delbrueckii cresce bem à temperatura de 45ºC; L. bulgaricus, pode ser incubado em 45-50ºC; já L. pentosus, L. casei, e Streptococcus lactis podem ser cultivados em 30ºC (PRESCOTT et al, 1959). 20 O ácido lático é bastante utilizado na indústria de alimentos como acidulante e conservante de refrigerantes, geléias, xaropes e sucos de frutas (LIMA et al., 2001). 3.3- FERMENTAÇÃO DO GLICEROL O glicerol é usado amplamente como solvente, adoçante, constituinte de loções, anti-sépticos, adesivos, tintas, agente anti-congelante. Ele também é utilizado na preparação de meios nutritivos biológicos e na produção de nitroglicerina, borracha sintética e massa de modelar (PRESCOTT et al., 1959). Ao estudar vinhos e cervejas, Luis Pasteur observou que leveduras regularmente formavam glicerol. Um pouco antes da Primeira Guerra Mundial, Neuberg, ao tentar elucidar a fermentação alcoólica através da suplementação do meio de cultivo com sulfito de sódio, acabou descobrindo que dessa forma havia um incremento na produção de glicerol por leveduras (PRESCOTT et al., 1959). Normalmente, produz-se cerca de 3% de glicerol durante a fermentação alcoólica, mas, ao se alterar o pH através da adição de sais alcalinos (carbonato de amônio, bicarbonato de sódio, acetato de sódio ou fosfato dissódico), é possível obter de 9 a 16% de glicerol (CROCOMO, 1967). Segundo os trabalhos de Neuberg, a produção de glicerol pode ser feita de quatro maneiras: fermentação alcoólica normal, presença de sulfito, soluções alcalinas ou soluções neutras. No primeiro caso (Figura 11), durante a fermentação alcoólica, pode ser desviado um pouco de gliceraldeído 3-fosfato, transformado em diidroxiacetona fosfato. Esta, por sua vez, sofre a ação de desidrogenase de glicerofosfato, reduzindo um NADH e formando glicerol 3-fosfato. A enzima fosfatase retira o fosfato desse composto e forma o glicerol. (CROCOCOMO, 1967) Figura 11- Produção de glicerol durante a fermentação alcoólica Fonte: Adaptado de CROCOMO, 1967. 21 Já na presença de sulfito, haverá acúmulo maior de glicerol. Isso ocorre devido a fixação do acetaldeído pelo sulfito de sódio, através da reação: CH3-CHO + Na2SO3 + H2O  CH3-CHO-HSO3Na + NaOH (PRESCOTT et al, 1959) Normalmente o acetaldeído é transformado em etanol, mas como ele está sendo fixado e a redução a etanol não acontece, uma outra molécula faz o papel de aceptor de hidrogênio do NADH. Isso faz com que a via de formação de glicerol seja favorecida (PRESCOTT et al, 1959). A fermentação utilizando sulfito foi utilizada pelos alemães durante a Primeira Guerra Mundial. Outros agentes que impeçam a transformação de aldeído a álcool também podem ser utilizados, como carvão, hidrazidas e oxalato de fenilhidrazina, desde que não haja impedimento de outras reações in vivo (CROCOMO, 1967). Quando a fermentação ocorre em meio alcalino, há uma alteração no curso normal da fermentação, gerando a produção de etanol, ácido acético, glicerol e CO2. Nessas condições, o acetaldeído não é reduzido a etanol, mas sim sofre a ação da mutase aldeídica, formando ácido acético e etanol (Figura 12). Como não ocorreu a reoxidação do NADH, a formação do glicerol a partir de diidroxiacetona fosfato é favorecida (CROCOMO, 1967). Figura 12- Ação da mutase aldeídica Fonte: CROCOMO, 1967. A última forma de fermentação seria em meio neutro. Nesse caso não haverá produção de etanol nem CO2, sendo acumulados glicerol e ácido pirúvico. Essa reação ainda não está muito bem elucidada, mas é representada como: C6H12O6  CH3-CO-COOH + CH2OH-CH2OH-CH2OH (CROCOMO, 1967)