Clonagem gênica de translocações t(1;5) em doenças mieloproliferativas: PDGFRB e imatinib, Manuais, Projetos, Pesquisas de Ciências Biologicas

Baixe Clonagem gênica de translocações t(1;5) em doenças mieloproliferativas: PDGFRB e imatinib e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Ciências Biologicas, somente na Docsity! 1 Clonagem gênica da t(1;5)(q23;q33) em doença mieloproliferativa associada à eosinofilia : envolvimento do PDGFRB e resposta a imatinib Elvira R P Velloso, Luiz Fernando Lopes e Ricardo C T Aguiar Trabalho realizado com a cooperação do Dana Faber Cancer Institute e Harvard Medical School, Boston, MA, Hospital A. C. Camargo, São Paulo, Brasil, e Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. Endereços: Ricardo C T Aguiar, Department of Medical Oncology, Dana Farber Cancer Institute-Harvard Medical School, 44 Binney St, Room M514, Boston MA 02115, e-mail: Ricardo_Aguiar@dfci.harvard.edu Elvira R P Velloso, Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Av. Enéas de Carvalho Aguiar, 155, 10 andar, SP, Brasil, CEP: 05403- 000, e-mail: elvira@sti.com.br Luiz Fernando Lopes, Serviço de Oncologia Pediátrica, Hospital A C Camargo, Rua Prof. Antônio Prudente, 211 , SP, Brasil, CEP: 01509-900, e-mail: lf.lopes@sti.com.br Trabalho publicado na revista Blood 102:4187-4190; 2003. 2 INTRODUÇÃO A detecção de genes alterados nas translocações cromossômicas recorrentes possibilitou o entendimento das bases moleculares das neoplasias hematológicas e o desenvolvimento de ensaios moleculares para diagnóstico e monitorização da terapêutica. Este conhecimento possibilitou também o desenvolvimento racional de drogas específicas, incluindo o mesilato de imatinib (Gleevec; Novartis, Basiléia, Suíça), um inibidor de um grupo restrito de tirosina quinases1. A eosinofilia é um achado freqüente em várias Síndromes Mieloproliferativas (SMP), principalmente na Leucemia Mielóide Crônica (LMC) e na Doença Mieloproliferativa 8p112,3. Causas menos comuns de eosinofilia incluem as SMP associadas a translocações envolvendo as regiões cromossômicas 5q31-334. A clonagem destas translocações mostrou o envolvimento sistemático do gene do receptor β do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRB). Em todos os casos de translocações envolvendo PDFGRB, os parceiros gênicos incluem domínios protéicos capazes de oligomerização e consequente ativação constitutiva da tirosina quinase do PDGFRB5-9. Além disso, recentemente se demonstrou que deleções crípticas da região cromossômica 4q12 resultando em ativação do PDGFRA são encontradas em casos de síndromes hipereosinofílicas (SHE)10, sugerindo que a ativação de genes da família PDGFR é um achado comum a doenças que compartilham alterações fenotípicas semelhantes. Um subgrupo de doenças mieloproliferativas com eosinofilia se apresenta com a t(1;5)(q23;q33)11,12. Neste trabalho é descrita a clonagem molecular desta translocação, a caractererização, in vitro, dos aspectos funcionais desta anormalidade e a conseqüência clínico- terapêutica deste achado. 5 Western blot Foi extraída proteína de células do sangue da paciente ao diagnóstico e 2 meses após o início do tratamento com imatinib. Os anticorpos contra AKT total e fosfo-AKT (S473) (Cell Signaling, MA) foram utilizados nestes experimentos. Proteína também foi isolada de células Ba/F3 expressando as fusões PDE4DIP-PDGFRB descritas acima. Estas proteínas foram submetidas a imunoprecipitação com anticorpos direcionados contra PI3K, PLCgamma, AKT, STAT5 e PDGFRB. Em subseqüentes análises com técnica de Western blot foram utilizados os anticorpos fosfo-AKT, fosfo-STAT5 (Cell Signaling) e fosfo-tirosinas (4G10, Upstate). Hibridação in situ por florescência (FISH) com duas cores Uma população celular enriquecida por eosinófilos foi processada do sangue do paciente, conforme técnica descrita previamente14. Utilizaram-se clones de cromossomos artificiais de bactéria (BAC) mapeando nas região centromérica (CTC-307M15, CTB-46E9 e CTB-13H5) e telomérica (CTB-5M9, CTB-108B20 E CTB-171P15) ao locus do PDGFRB. BAC DNAs foram hibridados com as lâminas da paciente3 e estas foram contra-coradas com DAPI (4´, 6´diamedino-2-fenilindol). As imagens foram processadas utilizando-se microscópio de fluorescência AX70 da Olympus e software de imagem da Genus (Applied Imaging, Santa Clara, CA). A avaliação da resposta citogenética após tratamento foi realizada através da fixação das células em lâminas, hibridação com sondas de PDGFRB, e leitura da presença ou ausência do rearranjo do PDGFRB no Sistema Bio View Duet Imaging (Rehovot, Israel). 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO Clonagem gênica da t(1;5)(q23;q33) A análise do Southern Blot mostrou a presença do rearranjo do gene do PDGFRB no DNA de células contendo a t(1;5) (Figura 1A). Posteriormente, o seqüenciamento de vários clones derivados da 5´RACE-PCR mostraram a mesma seqüência fundida “in-frame” ao exon 11 do gene PDGFRB. A pesquisa em banco de dados (www.ncbi.org) confirmou que estas seqüências estavam presentes na região cromossômica 1q21-23 e correspondiam a um novo gene, PDE4DIP (proteína de interação com a fosfodiesterase 4D - miomegalina). A análise por Southern blot com sonda PDE4DIP confirmou sua ruptura nesta translocação (dado não mostrado em figura). O RNA mensageiro quimérico PDE4DIP-PDGFRB foi facilmente detectado na paciente com t(1;5), o mesmo não ocorrendo em 2 controles normais (Figura 1B). A miomegalina é a proteína codificada pelo gene PDE4DIP e é caracterizada por sua associação com a fosfodiesterase PDE4D15. Em relação a esta translocação, é relevante que a miomegalina codifica diversos sítios de oligomerização capazes de ativar o PDGFRB (Figura 1C). Em humanos existem pelo menos duas isoformas principais de miomegalina (KIAA0454 e KIAA0477) codificando regiões N e C terminais distintas (Figura 1C). Esta característica possui significância, dado que uma destas isoformas codifica um potencial domínio ativador (leucine zipper, LZ) na região N-terminal. Surpreendentemente, no caso aqui relatado, o PDGFRB está fundido a isoforma KIAA0477, que não possui o domínio LZ (figura 1C), fato que indiretamente sugere que ativação do PDGFRB depende de outras regiões ("coiled-coil domains"). 7 Nesta proteína de fusão, os primeiros 905 amino-ácidos da miomegalina são ligados “in-frame” ao domínio transmembrana do PDGFRB (Figura 1D). Assim, é altamente sugestivo de que a desregulação da atividade do PDGFRB é o principal fator patogênico desta doença mieloproliferativa. Confirmação funcional do papel da fusão PDE4DIP-PDGFRB no desenvolvimento da síndrome mieloproliferativa associada com a translocação t(1;5). Várias formas da fusão gênica envolvendo PDE4DIP e PDGFRB foram clonadas no retrovirus MSCV (Figura 2A) e utlizadas para infectar células Ba/F3. O crescimento destas células na ausência de IL-3 é um ensaio clássico para se confirmar a capacidade de transformação maligna de um determinado produto gênico6-10. Portanto, o fato de todas as fusões miomegalina (MM)-PDGFRB, mas não o PDGFRB ou o vetor isolado, terem levado estas células à independência de IL-3 (Figura 2B) corrobora a hipótese de que esta fusão gênica é responsável pela síndrome mieloproliferativa encontrada nesta criança. Adicionalmente, o fato da região de miomegalina localizada próxima ao PDGFRB (fusão M2, Figura 2A) ser capaz de transformar as células Ba/F3 indica que o domínio LZ não é necessário para ativação do PDGFRB e que esta ativação está relacionada aos domínios "coiled- coil". A fusão miomegalina-PDGFRB ativa a função tirosina quinase de PDGFRB e de outras proteínas associadas com transformação maligna. Em ensaios funcionais, observamos que a proteína PDGFRB quando em fusão com miomegalina apresenta fosforilação dos resíduos tirosina aumentada (Figura 3A). Este resultado indica que PDGFRB encontra-se ativado nesta circunstância resultando em sinais que classicamente promovem proliferação celular, migração, angiogênese e bloqueio da apoptose. De fato, grande 10 mostrado que as regiões distais dos domínios “coiled-coil” da proteína miomegalina são suficientes para ativarem PDGFRB, transformarem células Ba/F3 e resultarem em incremento na fosforilação de PI3K, AKT, PLCgamma e STAT5. De relevância, este estudo mostrou que remissão clínica e resposta citogenética maior podem ser atingidas com imatinib nestes casos, mesmo em presença de doença refratária e progressiva. Apesar de poucos casos de SMP com t(1;5)(q23;q33)11,12 terem sido descritos, esta doença parece mais comum em crianças. Ressaltamos a importância do hematologista estar atento a SMP com eosinofilia e ao potencial uso do imatinib nestas doenças. 11 RESUMO Eosinofilia é um achado freqüente nas síndromes mieloproliferativas (SMP) que cursam com anormalidades citogenéticas envolvendo as bandas 5q31-33, entre elas a t(1;5)(q23;q33). A clonagem de genes envolvidos em translocações cromossômicas aumentam o nosso entendimento das bases moleculares do câncer, definem novas provas moleculares para diagnóstico e seguimento e podem levar ao desenvolvimento de drogas específicas, terapêutica eficaz e eventualmente prolongar a sobrevida de pacientes. Neste trabalho, foi clonada a translocação t(1;5)(q23;q33) e demostrou-se que a mesma leva a fusão do receptor β do fator de crescimento derivado de plaquetas (platelet-derived growth factor receptor beta – PDGFRB) com uma nova proteína, a miomegalina. Estudos in vitro, confirmaram que esta fusão é capaz de transformar células Ba/F3, ativar PDGFRB e vários dos seus substratos. Observou-se também que os eosinófilos fazem parte do clone anormal, através da utilização da técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH) com duas cores em intérfase. O mesilato de imatinib recentemente se mostrou eficaz nas SMP que cursam com ativação de PDGFR. O estudo molecular neste caso, proporcionou modificar o tratamento da paciente. Apesar da mesma ser portadora de doença refratária a várias medicações, remissão clínica, hematológica e resposta citogenética maior foram obtidas com o uso de imatinib. Dadas estas implicações terapêuticas, este trabalho reforça a necessidade de se investigar a base molecular das doenças mieloproliferativas, com ênfase especial na família dos receptores de PDGF. 12 ABSTRACT Eosinophilia is common in myeloproliferative disorders (MPDs) with abnormalities of chromosome band 5q31-33, including those that present with t(1;5)(q23;q33). With the development of rational drug therapy, characterization of the molecular targets for these translocations could guide treatment and affect patient survival. We cloned the t(1;5)(q23;q33) and showed that it fuses platelet- derived growth factor receptor beta (PDGFRB) to the coiled-coil domains of a novel partner protein, myomegalin. This novel fusion transforms Ba/F3 cells to IL-3 independency and activates PDGFRB and a variety of its downstream targets, including PI3K, AKT, PLCγ and STAT5. Mapping studies defined that the most C-terminal coiled-coil domain of myomegalin is sufficient to constitutively activate PDGFRB and transform Ba/F3 cells. Using two-color interphase fluorescence in situ hybridization (FISH), we also demonstrated that the eosinophils are clonal in these disorders. Imatinib mesylate has recently been shown to be efficacious in MPDs with PDGFR activation. Therefore, following our molecular studies, we were able to redirect this patient's treatment. Although she had refractory and progressive disease, once imatinib was started, complete clinical and hematologic remission, as well as major cytogenetic response, were achieved. Given the therapeutic implications, our findings stress the need to aggressively investigate the molecular basis of these diseases, with emphasis on the PDGFR family. 15 Figura 3: A fusão miomegalina-PDGFRB ativa a função tirosina quinase de PDGFRB e de outras proteínas associadas com transformação maligna. A) Imunoprecipitação da proteína PDGFRB seguida de detecção por western blot dos níveis de fosforilação dos resíduos de tirosina confirmam que a fusão gênica associada com a t(1;5) induz fosforilação constitutiva do PDGFRB. B) Imunoprecipitação e detecção dos níveis de fosforilação de vários substratos do PDGFRB confirmam que a t(1;5) resulta em ativação do PDGFRB e seus substratos. AKT pAKT M SC V M 2- PD GF RB M 1- PD GF RB IP-AKT IBIB IP-PLCγ pTyr PLCγ STAT 5 pSTAT5 M SC V M 2- PD GF RB M 1- PD GF RB IP-STAT5 IP-PI3K pTyr PI3K M SC V M 2- PD GF RB M 1- PD GF RB M SC V M 2- PD GF RB M 1- PD GF RB IP-PDGFRB M SC V M 2- PD GF RB M 1- PD GF RB PD GF RB 220 125 kD IB-pTyr M SC V M 2- PD GF RB M 1- PD GF RB PD GF RB A) B) 16 Figura 4. Os eosinófilos têm rearranjo do locus do PDGFRB e fazem parte do clone neoplásico em casos de SMP com t(1;5) . Ensaio por FISH com 2-cores em intérfase de preparação enriquecida com eosinófilos foi utilizado para definir clonalidade destas células. Foram usados como sondas BAC com diferentes marcações: localizados em região centromérica (vermelho) ou telomérica (verde) a região de quebra do PDGFRB. À esquerda é feita representação esquemática do cromossomo 5, localização do ponto de quebra e as sondas. Nas metáfases e intérfases normais (acima) os sinais vermelho e verde estão justapostos (amarelo) nos dois cromossomos 5. Nos eosinófilos do sangue da paciente (abaixo), um par de sinais estão justapostos (cromossomo 5 normal), enquanto os outros sinais estão divididos, indicando o rearranjo do locus do PDGFRB. Os grânulos dos eosinófilos foram pseudo-colorizados em branco para evitar a auto-fluorescência. Controle normal Eosinofilos na mieloproliferacao com t(1;5)(q23;q33) Cr 5 17 Figura 5. Resposta clínica e hematológica ao tratamento com imatinib. Os gráficos apresentam os resultados dos parâmetros clínicos e laboratoriais do início até o 70 mês do tratamento. A remissão clínica e hematológica foi obtida em aproximadamente 8 semanas. Leucocitos 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 45,000 0 2 4 12 28 34 74 100 210 Dias pos-imatinib Plaquetas 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 0 2 4 12 28 34 74 100 210 Dias pos-imatinib Eosinofilos 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% 18% 20% 0 2 4 12 28 34 74 100 210 Dias pos-imatinib Tamanho do baco 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 12 28 34 74 100 210 Dias pos-imatinib