Enzimas

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Capítulo 3

3 Enzimas

Objetivos

1. Compreender a sistematização da nomenclatura enzimática.

2. Descrever as classes enzimáticas: hidrolase, transferase, isomerase, liase, ligase e oxirredutase.

3. Descrever a função de coenzimas e co-fatores na biocatálise.

4. Conceituar energia livre de ativação e correlacionar com a atividade enzimática.

5. Conceituar sítio ativo de uma enzima e correlacionar com atividade enzimática.

6. Conceituar número de renovação (turnover) e reconhecer sua significação biológica.

7. Conceituar especificidade enzimática e reconhecer sua significação biológica.

8. Descrever o efeito da temperatura e pH sobre a velocidade da reação enzimática.

9. Descrever o efeito da variação da concentração do substrato na velocidade da reação enzimática e indicar o significado do Km.

10. Descrever as semelhanças e diferenças entre inibição enzimática competitiva, não-competitiva e incompetitiva ao nível de sítio ativo.

1. Descrever a regulação alostérica e seus efeitos.

12. Reconhecer que o caráter sigmoidal da curva de substrato de uma proteína alostérica, depende da interação entre as subunidades e é modificado pela interação da proteína com o efetor.

A vida depende de uma bem orquestrada série de reações químicas. Muitas delas, entretanto, ocorrem muito lentamente para manter os processos vitais. Para resolver esse problema, a natureza planejou um modo de acelerar a velocidade das reações químicas por meio da catálise. As ações catalíticas são executadas por enzimas que facilitam os processos vitais em todas as suas formas, desde os vírus até os mamíferos superiores.

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Quadro 3.1 Natureza química das enzimas

A palavra enzima foi introduzida por Kuhne em 1878 para designar a ocorrência no levedo de algo responsável pela sua atividade fermentativa. Berzelius, 50 anos antes, tinha reconhecido a presença de fermentos de ocorrência natural que promoviam reações químicas e antecipou o conceito de catalisadores biológicos. Berzelius classificou os fermentos em “organizados” e “não-organizados” com base na presença ou ausência de microorganismos intactos. Kuhne aplicou a palavra enzima aos fermentos derivados de extratos de levedos, i.e. “fermentos não-organizados”.

Em 1897, Büchner preparou um filtrado de extratos de levedo que foi o primeiro extrato enzimático removido de células vivas que pode catalisar a fermentação.

A natureza química das enzimas permaneceu controversa. Em 1926, Sumner cristalizou a urease a partir de extratos de feijão, no entanto, a preparação tinha pequena atividade catalítica e outros investigadores atribuíram o efeito catalítico a contaminantes e não à proteína. Willstätter, por outro lado, prurificou a peroxidase com elevada capacidade catalítica e ausência de outras proteínas. No início dos anos 30, Northrop e cols. cristalizaram a pepsina e a tripsina demonstrando definitivamente que as enzimas eram proteínas.

As enzimas são proteínas com a função específica de acelerar reações químicas que ocorrem sob condições termodinâmicas não−favoráveis. Elas aceleram consideravelmente a velocidade das reações químicas químicas em sistemas biológicos quando comparadas com as reações correspondentes não−catalisadas. Para ser classificada como enzima, uma proteína deve:

• Apresentar extraordinária eficiência catalítica.

• Demonstrar alto grau de especificidade em relação a seus substratos (reagentes) e aos seus produtos.

• Acelerar a velocidade das reações em 106 a 1012 vezes mais do que as reações correspondentes não-catalisadas.

• Não ser consumida ou alterada ao participar da catálise.

• Não alterar o equilíbrio químico das reações.

• Ter sua atividade regulada geneticamente ou pelas condições metabólicas.

Tabela 3.1 – Velocidade de reações não−catalisadas e catalisadas por enzimas

Enzima Não−catalisada (s)

Catalisada (s)

Aumento da velocidade

Anidrase carbônica 1,3 x 10 1.0.0 7,7 x 10 Adenosina−deaminase 1,8 x 10 370 2,1 x 10 Nuclease estafilocócica 1,7 x 10 95 5,6 x 10 Triose−fosfato−isomerase 4,3 x 10 4.300 1,0 x 10 Quimiotripsina 1,0 x 10 190 1,7 x 10 Orotidina−descarboxilase 2,8 x 10 39 1,4 x 10

3 Enzimas • 71 s = unidade da constante de velocidade de reação de primeira ordem

Quadro 3.2 Uso industrial das enzimas

A indústria biotecnológica produz várias enzimas para diferentes usos.

O uso de proteases em detergentes melhora a remoção de manchas de origem biológica, como o sangue e molhos. O termo “biológico” empregado nas embalagens de sabão em pó reflete a presença de proteases. As proteases são também utilizadas em restaurantes para amaciar a carne, por cervejeiros para eliminar a turvação nas cervejas, por padeiros para melhorar a textura do pão e em indústrias de luvas para amaciar o couro.

Outras enzimas também apresentam uso industrial. Por exemplo, a lipase é adiconada a líquidos detergentes para degradar graxas (lipídeos) e em alguns queijos para desenvolver aroma. A pectinase é usada na indústria de geléias para promover a máxima extração de líquido das frutas. As amilases são empregadas para degradar o amido em certos removedores de papel de parede para facilitar a sua retirada.definitivamente que as enzimas eram proteínas.

As proteínas não são únicas substâncias com propriedades catalíticas nos sistemas biológicos. Alguns RNA, denominados ribozimas, também executam essa função.

A reação catalisada por enzima pode ser esquematizada como segue:

A molécula sobre a qual a enzima atua é o substrato (S) que se transforma em produto (P) da reação. Na ausência de enzima pouco produto (ou nenhum) é formado, mas em presença da mesma, a reação se processa em alta velocidade. Como a maioria das reações é reversível, os produtos da reação numa direção tornam-se substratos para a reação inversa.

As enzimas são os catalisadores mais específicos que se conhece, tanto para o substrato como para o tipo de reação efetuada sobre o substrato. A especificidade inerente da enzima, reside em uma cavidade ou fenda de ligação do substrato, que está situada na superfície da proteína enzimática. A cavidade, denominada sítio ativo, é um arranjo de grupos presentes em cadeias laterais de certos aminoácidos que ligam o substrato por ligações não-covalentes. Muitas vezes, os resíduos de aminoácidos que formam o sítio ativo ficam em regiões distantes, na seqüência primária, mas próximos no sítio ativo, pelo enovelamento de cadeia polipeptídica (estrutura terciária).

Algumas enzimas têm outra região na molécula, o sítio alostérico, afastada do sítio ativo. No sítio alostérico moléculas pequenas específicas se ligam e causam alterações na conformação protéica que afetam o sítio ativo, aumentando ou reduzindo a atividade enzimática.

A maioria das enzimas necessitam de moléculas orgânicas ou inorgânicas pequenas, essenciais à sua atividade e denominadas coenzimas e co-fatores.

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3.1 Classificação das enzimas

Com a descoberta de grande número de enzimas, houve a necessidade de sistematização da nomenclatura. A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) adotou um sistema racional e prático de nomenclatura identificando as enzimas em seis classes, de acordo com a natureza da reação química que catalisam. Para cada enzima, são atribuídos dois nomes e um número de classificação de quatro dígitos que identificam as classes, as subclasses e as sub-subclasses.

Na classificação internacional sistemática, as enzimas são divididas em seis grupos de acordo com o tipo de reação catalisada (Tabela 3.1).

Tabela 3.1 – Classificação das enzimas

Classe da enzima Tipo de reação catalisada

Oxidorredutases Reações de oxidação−redução Transferases Transferência de grupos funcionais Hidrolases Reações de hidrólise Liases Remoção de grupos para formar ligações duplas Isomerases Isomerização Ligases Formação de ligações entre duas moléculas

Por exemplo, a enzima glicose−6−fosfatase (nome trivial), tem como nome sistemático D-Glicose−6−fosfato fosfohidrolase e número de classificação EC 3.1.3.9. Os números representam a classe (3, hidrolase), subclasse (1, atua sobre ligações éster), sub−subclasse (3, fosforil monoéster hidrolase) e seu número de série dentro da subsubclasse (9). A sigla “EC” é a abreviatura de Enzyme Comission).

Muitas enzimas de uso rotineiro são designadas pelo nome alternativo ou trivial. Por exemplo, algumas são denominadas pela incorporação do sufixo −ase ao nome do substrato sobre os quais elas atuam; por exemplo, a enzima que hidrolisa a uréia é denominada urease; o amido, a amilase; ésteres do fosfato, as fosfatases. Outras são designadas pelo tipo de ação catalítica que realizam, tais como, anidrase carbônica; D−amino oxidase; lactato desidrogenase. Algumas levam nomes vulgares como a tripsina, pepsina, emulsina, etc.

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Quadro 3.3 Enzimas usadas como agentes terapêuticos

Algumas enzimas são empregadas como agentes terapêuticos no tratamento de diferentes doenças. As proteases, amilases e lípases são usadas para auxiliar a digestão.

A asparaginase é usada no tratamento da leucemia linfocítica aguda. As células normais são capazes de sintetizar asparagina enquanto certas células tumorais, inclusive as leucêmicas, não produzem o derivado do aminoácido. A administração intravenosa de asparaginase reduz o nível plasmático de asparagina e, assim, diminui o desenvolvimento de células leucêmicas.

A desoxiribonuclease (DNase) é útil no tratamento da fibrose cística. A principal característica da fibrose cística são as infeções respiratórias recorrentes, particularmente devido a Pseudomonas aeroginosa, o que resulta em grandes quantidades de DNA proveniente das bactérias destruídas e morte das células fagocíticas do sistema imune. O DNA contribui para a viscosidade do muco que provoca sintomas aflitivos. A DNase é usada para degradar o DNA e diluir o muco.

A estreptocinase é empregada na remoção de coágulos sangüíneos no infarto do miocárdio e nas extremidades dos membros inferiores. Ativa a transformação da proenzima fibrinolítica plasminogênio à plasmina, uma enzima que quebra a fibrina insolúvel do coágulo sangüíneo.

3.2 Co-fatores metálicos e coenzimas

Algumas enzimas são proteínas simples consistindo inteiramente de cadeias polipeptídicas, como as enzimas hidrolíticas pepsina, tripsina, lisozima e ribonuclease. Entretanto, a maioria das enzimas somente exercem sua atividade catalítica em associação com co−fatores metálicos e coenzimas.

1. Co-fatores metálicos. Os metais importantes nos organismos vivos são classificados em dois grupos: metais de transição (exemplo, Fe2+, Zn2+ e Cu2+) e metais alcalinos e alcalinos terrosos (exemplo, Na+, K+, Mg2+ e Ca2+). Devido a sua estrutura eletrônica, os metais de transição estão freqüentemente envolvidos na catálise.

Várias propriedades dos metais de transição os tornam essenciais para a catálise. Os íons metálicos apresentam um grande número de cargas positivas especialmente úteis na ligação de pequenas moléculas. Os metais de transição atuam como ácidos de Lewis (aceptores de pares eletrônicos), e são eletrófilos efetivos. Como suas valências permitem interagirem com dois ou mais ligantes, os íons metálicos participam na orientação apropriada do substrato para a reação. Como conseqüência, o complexo substrato-íon metálico polariza o substrato e promove a catálise. Exemplo, quando o Zn2+, co−fator da anidrase carbônica, polariza uma molécula de água, forma-se um grupo OH ligado ao Zn2+ (função de ácido de Lewis do zinco). O grupo OH ataca nucleofilicamente o CO2, convertendo-o em

HCO3-. Finalmente, como os metais de transição têm dois ou mais estados de oxidação, eles podem mediar reações de oxidação−redução. Por exemplo, a oxidação reversível do Fe2+ para formar Fe3+ é importante na função do citocromo P450, uma enzima microssomal que processa substâncias tóxicas.

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2. Coenzimas. São moléculas orgânicas pequenas, frequentemente derivadas de vitaminas. Existem também certos nutrientes análogos às vitaminas (exemplo, ácido lipóico e ácido p−aminobenzóico) que são sintetizados em pequenas quantidades e que facilitam os processos catalisados por enzimas. Na Tabela 3.1 são listadas as coenzimas, as reações que elas participam e as fontes vitamínicas que dão origem as coenzimas.

A enzima é cataliticamente ativa quando forma um complexo denominado holoenzima. O componente protéico do complexo é designado de apoenzima.

Holoenzima (ativa) ' co−fator + apoenzima (inativa)

Quadro 3.2 – Coenzimas/co-fatores metálicos e enzimas

Coenzimas e co-fatores Enzima

Coenzima

Pirofosfato de tiamina (TTP) Piruvato−desidrogenase Flavina adenina dinucleotídeo (FAD) Monoaminooxidase

Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) Lactato−desidrogenase Piridoxal fosfato Glicogênio−fosforilase Coenzima A (CoA) Acetil−CoA−carboxilase Biotina Piruvato−carboxilase

Tetraidrofolato Timidilate−sintase

Co-fator metálico

Zn Anidrase−carbônica Zn Carboxipeptidase Mg Hexocinase

Quadro 3.1 – Algumas coenzimas, as reações que promovem e as vitaminas precursoras

Coenzima Reação Fonte vitamínica

Biocitina Carboxilação Biotina Coenzima A Transferência de grupos acila Ácido pantotênico Cobalamina Alquilação Cobalamina (B)

Flavina Oxidação−redução Riboflavina (B) Ácido lipóico Transferência de grupo acila - Nicotinamida Oxidação –redução Nicotinamida (niacina) Fosfato de piridoxal Transferência de grupo amino Piridoxina (B)

Tetraidrofolato Transferência de grupos de 1−carbono Ácido fólico

Pirofosfato de tiamina Transferência de grupo aldeído Tiamina (B) Retinal Visão, crescimento e reprodução Vitamina A 1, 25-diidroxicolecalciferol Metabolismo do cálcio e fósforo Vitamina D

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Ni Uréase Mo Nitrato−redutase Se Glutationa−peroxidase Mn Superóxido−dismutase K Propionil−CoA−carboxilase

3.3 Reações catalisadas por enzimas

Para reagir, as moléculas presentes em uma solução devem colidir com orientação apropriada e com a quantidade de energia que lhes permitam formar o complexo ativado, denominado estado de transição que representa os reagentes em seu estado ativado. Para atingir o estado de transição, necessita-se de uma quantidade de energia definida como energia de ativação (Ea) ou mais comum em bioquímica energia livre de ativação, ∆G╪ (o símbolo (╪) indica o processo de ativação). Sob condições fisiológicas, a velocidade das reações pode ser aumentada pela redução da energia livre de ativação conseguida pela ação de enzimas.

A comparação do perfil energético das reações catalisadas e nãocatalisadas é mostrada na Figura 3.1 para a reação:

No gráfico, o estado de transição corresponde ao ponto de mais alta energia da reação não-catalisada e é a medida da energia livre de ativação, ∆G╪. Ou ainda, ∆G╪ é a energia livre do estado de transição subtraída da energia livre dos reagentes. No complexo ativado (estado de transição do sistema), os reagentes estão em forma intermediária de alta energia e não podem ser identificados nem como reagentes nem como produtos. O complexo do estado de transição pode ser decomposto em produtos ou voltar aos reagentes.

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Figura 3.1 Diagrama energético de reação catalisada e de reação não-catalisada.

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