Baixe Apostila de Enzimas - Capítulo 3, Bioquímica Básica e outras Notas de estudo em PDF para Bioquímica, somente na Docsity! ANÁLISES CLÍNICAS Autolab a VALTER T. MOTTA BIOQUÍMICA BÁSICA Enzimas 3 Enzimas Objetivos Compreender a sistematização da nomenclatura enzimática. Descrever as classes enzimáticas: hidrolase, transferase, isomerase, liase, ligase e oxirredutase. Descrever a função de coenzimas e co-fatores na biocatálise. Conceituar energia livre de ativação e correlacionar com a atividade enzimática. Conceituar sítio ativo de uma enzima e correlacionar com atividade enzimática. Conceituar número de renovação (turnover) e reconhecer sua significação biológica. Conceituar especificidade enzimática e reconhecer sua significação biológica. Descrever o efeito da temperatura e pH sobre a velocidade da reação enzimática. Descrever o efeito da variação da concentração do substrato na velocidade da reação enzimática e indicar o significado do Km. Descrever as semelhanças e diferenças entre inibição enzimática competitiva, não-competitiva e incompetitiva ao nível de sítio ativo. Descrever a regulação alostérica e seus efeitos. Reconhecer que o caráter sigmoidal da curva de substrato de uma proteina alostérica, depende da interação entre as subunidades e é modificado pela interação da proteina com o efetor. A vida depende de uma bem orquestrada série de reações químicas. Muitas delas, entretanto, ocorrem muito lentamente para manter os processos vitais. Para resolver esse problema, a natureza planejou um modo de acelerar a velocidade das reações químicas por meio da catálise. As ações catalíticas são executadas por enzimas que facilitam os processos vitais em todas as suas formas, desde os vírus até os mamíferos superiores. 69 72 e MOTTA o Bioquímica 3.1 Classificação das enzimas Com a descoberta de grande número de enzimas, houve a necessidade de sistematização da nomenclatura A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (ITUBMB) adotou um sistema racional e prático de nomenclatura identificando as enzimas em seis classes, de acordo com a natureza da reação química que catalisam. Para cada enzima, são atribuídos dois nomes e um número de classificação de quatro dígitos que identificam as classes, as subclasses e as sub-subclasses. Na classificação internacional sistemática, as enzimas são divididas em seis grupos de acordo com o tipo de reação catalisada (Tabela 3.1). Tabela 3.1 — Classificação das enzimas Classe da enzima Tipo de reação catalisada Oxidorredutases Reações de oxidação-redução Transferases Transferência de grupos funcionais Hidrolases Reações de hidrólise Liases Remoção de grupos para formar ligações duplas Isomerases Isomerização Ligases Formação de ligações entre duas moléculas Por exemplo, a enzima glicose-6-fosfatase (nome trivial), tem como nome sistemático D-Glicose-6-fosfato fosfohidrolase e número de classificação EC 3.1.3.9. Os números representam a classe (3, hidrolase), subclasse (1, atua sobre ligações éster), sub-subclasse (3, fosforil monoéster hidrolase) e seu número de série dentro da sub- subclasse (9). A sigla “EC” é a abreviatura de Enzyme Comission). Muitas enzimas de uso rotineiro são designadas pelo nome alternativo ou trivial. Por exemplo, algumas são denominadas pela incorporação do sufixo -ase ao nome do substrato sobre os quais elas atuam; por exemplo, a enzima que hidrolisa a uréia é denominada urease; o amido, a amilase; ésteres do fosfato, as fosfatases. Outras são designadas pelo tipo de ação catalítica que realizam, tais como, anidrase carbônic D-amino oxidase; lactato desidrogenase. Algumas levam nomes vulgares como a tripsina, pepsina, emulsina, etc. 3 Enzimas é 73 Quadro 3.3 Enzimas usadas como agentes terapêuticos Algumas enzimas são empregadas como agentes terapêuticos no tratamento de diferentes doenças. As proteases, amilases e lipases são usadas para auxiliar a digestão. A asparaginase é usada no tratamento da leucemia linfocitica aguda. As células normais são capazes de sintetizar asparagina enquanto certas células tumorais, inclusive as leucêmicas, não produzem o derivado do aminoácido. A administração intravenosa de asparaginase reduz o nível plasmático de asparagina e, assim, diminui o desenvolvimento de células leucêmicas. A desoxiribonuclase (DNase) é útil no tratamento da fibrose cística A principal característica da fibrose cística são as infeções respiratórias recorrentes, particularmente devido a Pseudomonas aeroginosa, o que resulta em grandes quantidades de DNA proveniente das bactérias destruídas e morte das células fagocíticas do sistema imune. O DNA contribui para a viscosidade do muco que provoca sintomas aflitivos. A DNase é usada para degradar o DNA e diluir o muco. A estreptocinase é empregada na remoção de coágulos sanguíneos no infarto do miocárdio e nas extremidades dos membros inferiores. Ativa a transformação da —proenzima — fibrinolítica plasminogênio à plasmina, uma enzima que quebra a fibrina insolúvel do coágulo sanguíneo. 3.2 Co-fatores metálicos e coenzimas Algumas enzimas são proteínas simples consistindo inteiramente de cadeias polipeptídicas, como as enzimas hidrolíticas pepsina, tripsina, lisozima e ribonuclease. Entretanto, a maioria das enzimas somente exercem sua atividade catalítica em associação com co-fatores metálicos e coenzimas. 1. Co-fatores metálicos. Os metais importantes nos organismos vivos são classificados em dois grupos: metais de transição (exemplo, Fe”, Zn” e Cu?) e metais alcalinos e alcalinos terrosos (exemplo, Na”, K', Mg”' e Ca?'). Devido a sua estrutura eletrônica, os metais de transição estão frequentemente envolvidos na catálise. Várias propriedades dos metais de transição os tornam essenciais para a catálise. Os íons metálicos apresentam um grande número de cargas positivas especialmente úteis na ligação de pequenas moléculas. Os metais de transição atuam como ácidos de Lewis (aceptores de pares eletrônicos), e são eletrófilos efetivos. Como suas valências permitem interagirem com dois ou mais ligantes, os íons metálicos participam na orientação apropriada do substrato para a reação. Como consequência, o complexo substrato-íon metálico polariza o substrato e promove a catálise. Exemplo, quando o Zn”, co-fator da anidrase carbônica, polariza uma molécula de água, forma-se um grupo OH ligado ao Zn?” (função de ácido de Lewis do zinco). O grupo OH ataca nucleofilicamente o CO», convertendo-o em HCO;. Finalmente, como os metais de transição têm dois ou mais estados de oxidação, eles podem mediar reações de oxidação-redução. Por exemplo, a oxidação reversível do Fe”” para formar Fe” é importante na função do citocromo P4so, uma enzima microssomal que processa substâncias tóxicas. T4 e MOTTA o Bioquímica Quadro 3.1 - Algumas coenzimas, as reações que promovem e as vitaminas precursoras Coenzima Reação Fonte vitamínica Biocitina Coenzima A Cobalamina Flavina Ácido lipóico Nicotinamida Fosfato de piridoxal Tetraidrofolato Pirofosfato de tiamina Retinal 1, 25-diidroxicolecalciferol Carboxilação Transferência de grupos acila Alquilação Oxidação-redução Transferência de grupo acila Oxidação -redução Transferência de grupo amino Transferência de grupos de I-carbono Transferência de grupo aldeido Visão, crescimento e reprodução Metabolismo do cálcio e fósforo Biotina Ácido pantotênico Cobalamina (B,) Riboflavina (B,) Nicotinamida (niacina) Piridoxina (Bo) Ácido fólico Tiamina (B1) Vitamina A Vitamina D 2. Coenzimas. São moléculas frequentemente derivadas de vitaminas. nutrientes análogos às vitaminas (exemplo, ácido lipóico e ácido p-aminobenzóico) que são sintetizados em pequenas quantidades e que facilitam os processos catalisados por enzimas. Na Tabela 3.1 são listadas as coenzimas, as reações que elas participam e as fontes vitamínicas que dão origem as coenzimas. A enzima é cataliticamente ativa quando forma um complexo denominado holoenzima. O componente protéico do complexo é designado de apoenzima. orgânicas pequenas, Existem também certos Holoenzima (ativa) S co-fator + apoenzima (inativa) Quadro 3.2 — Coenzimas/co-fatores metálicos e enzimas Coenzimas e co-fatores Enzima Coenzima Pirofosfato de tiamina (TTP) Flavina adenina dinucleotídeo (FAD) Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) Piridoxal fosfato Coenzima A (CoA) Biotina Tetraidrofolato Piruvato-desidrogenase Monoaminooxidase Lactato-desidrogenase Glicogênio-fosforilase Acetil-CoA-carboxilase Piruvato-carboxilase Co-fator metálico Zn” Timidilate-sintase Anidrase-carbônica Carboxipeptidase Hexocinase 3 Enzimas é 77 3.4 Sítio ativo catalítico Sítio ativo é a região na superfície da enzima onde ocorre a catálise. O substrato liga-se ao sítio ativo por ligações não-covalentes (interações eletrostáticas, pontes de hidrogênio, interações de van der Waals e interações hidrofóbicas). Os grupos que participam das ligações são: a carboxila do ácido glutâmico ou do ácido aspártico, o grupo e-amino da lisina, o imidazol da histidina, a hidroxila da serina, etc. Somente uma pequena porção do substrato onde ocorre transformação está ligada à enzima. Isso não implica, entretanto, que os aminoácidos no sítio ativo estejam um ao lado do outro na estrutura primária da proteína. Em consequência das dobras e enovelamento da enzima (estrutura secundária e terciária), certos resíduos de aminoácidos podem estar distantes um do outro na sequência primária, ainda que juntos no sítio ativo da proteína completa. A especificidade da ligação enzima-substrato depende do arranjo precisamente definido de átomos no sítio ativo. Uma das explicações para a elevada especificidade das enzimas é que suas estruturas tridimensionais permitem um perfeito encaixe com o substrato. Dois modelos foram propostos para explicar a especificidade enzimática, o modelo chave-fechadura e o modelo do encaixe induzido. 1. Modelo chave-fechadura. Muitas enzimas contêm fendas com dimensões fixas que permitem a inserção somente de compostos com uma dada configuração. O substrato se ajusta a esse sítio de ligação como uma chave se ajusta à sua fechadura. Substâncias que não se encaixam na fenda para formar o complexo enzima-substrato (ES), não reagem, mesmo possuindo grupos funcionais idênticos ao do substrato verdadeiro. Esse conceito é chamado modelo chave-fechadura proposto por Fisher em 1890. RP EEE E+s Es * (Es - EP) + E+P Figura 3.2 Modelo chave-fechadura. A interação entre a enzima (com estrutura rígida) e seu substrato. 2. Modelo do encaixe induzido. Um modelo mais flexível de interação enzima-substrato é o encaixe induzido (induced-fit) proposto por Koshland em 1958. Os sítios ativos dessas enzimas não estão completamente pré-formados e a interação inicial do substrato com a enzima induz uma alteração conformacional na enzima. Isso promove o reposicionamento dos aminoácidos catalíticos para formar 78 e MOTTA o Bioquímica o sítio ativo e a estrutura correta para interagir com os grupos funcionais do substrato (Figura 3.3). Ca-(4-a Es Figura 3.3 Modelo do encaixe induzido. A ligação inicial do substrato à enzima induz uma mudança conformacional na enzima produzindo um melhor encaixe. 3.5 Mecanismos catalíticos As reações químicas envolvidas na transformação dos substratos variam com os mecanismos de ação das enzimas. Os principais tipos de mecanismos catalíticos que as enzimas utilizam são: (1) efeitos de proximidade e orientação, (2) catálise eletrostática, (3) catálise ácido- básica e (4) catálise covalente. 1. Efeitos de proximidade e orientação. Os substratos se aproximam dos grupos funcionais catalíticos da enzima em uma orientação espacial apropriada para que a reação possa ocorrer. Após o correto posicionamento do substrato, uma modificação na conformação da enzima resulta em um complexo enzima-substrato orientado. Essa orientação leva o complexo enzima-substrato ao estado de transição. 2. Catálise por íons metálicos. A força das interações eletrostáticas está relacionada com a capacidade das moléculas solventes vizinhas em reduzir os efeitos de atração entre os grupos químicos. Como a água é excluída do sítio ativo quando o substrato se liga, a constante dielétrica local é muitas vezes baixa. A distribuição de cargas nos sítios ativos das enzimas pode influenciar a reatividade química do substrato. Uma ligação mais eficiente do substrato reduz a energia livre do estado de transição, que acelera a reação. 3. Catálise ácido-básica geral. Os grupos químicos podem se tornar mais reativos pela adição ou remoção de prótons. Os sítios ativos das enzimas contêm cadeias laterais que podem atuar como doadores ou receptores de prótons. Esses grupos são denominados ácidos gerais ou bases gerais. Por exemplo, a cadeia lateral da histidina (grupo imidazol) muitas vezes atua como catalisador ácido e/ou básico em concerto porque tem pK, na faixa de pH fisiológico. 4. Catálise covalente. Acelera a velocidade da reação pela formação de uma ligação covalente transitória entre a enzima e o substrato. Um grupo nucleofílico da cadeia lateral do catalisador 3 Enzimas é 79 forma uma ligação covalente instável com um grupo eletrofílico do substrato. O complexo enzima-substrato então forma o produto. A. Mecanismo de ação da lisozima O mecanismo de ação da lisozima emprega tanto a distorção da cadeia polissacarídica como a catálise ácido-básica geral. A lisozima é uma enzima com cadeia polipeptídica única com 129 resíduos de aminoácidos. A lisozima, uma glicosidase, destrói as paredes das células bacterianas ao hidrolisar a ligação glicosídica entre o N-acetilmuramato e N-acetilglicosamina. A molécula da lisozima tem uma fenda, à qual os substratos se ligam por ligações pontes de hidrogênio e forças de van der Waals. O mecanismo catalítico da lisozima envolve o ácido glutâmico 35, na sua forma não-carregada, que atua como catalisador ácido para clivar o substrato polissacarídico pela doação de um H” ao oxigênio da ponte entre os anéis De E. O C; do anel D fica, então, com carga positiva O íon axônio resultante carregado positivamente e planar, é eletrostaticamente estabilizado pelo aspartato 52 na sua forma de carboxilato. A reação é facilitada pela distorção do resíduo D na conformação planar de meia-cadeira, o que permite que a carga positiva seja compartilhada entre o C-1 e o átomo de oxigênio do anel. Figura 3.4 Estrutura da lisozima. 82 e MOTTA o Bioquímica Velocidade Figura 3.6 Atividade enzimática versus pH (considerando-se os outros fatores constantes) C. Concentração da enzima A velocidade máxima da reação é uma função da quantidade de enzima disponível, aquela aumenta proporcionalmente pela introdução de mais enzima ao sistema. Assim, a velocidade inicial da reação enzimática é diretamente proporcional à concentração de enzima (existindo substrato em excesso) (Figura 3.7). Velocidade inicial vo —» Concentração de enzima —— Figura 3.7 Efeito da concentração da enzima sobre a velocidade inicial (vo). A concentração do substrato está acima da necessária para atingir a velocidade máxima. D. Concentração do substrato Para atender as necessidades do organismo, as reações bioquímicas devem ocorrer em velocidade compatível. A velocidade de uma reação bioquímica é expressa em termos de formação de produto ou pelo consumo do reagente por unidade de tempo. Ao considerar uma reação unimolecular (que envolve um único reagente): ASP 3 Enzimas e 83 O progresso da reação é descrita pela equação da velocidade na qual a velocidade é expressa em termos da constante de velocidade (k) e a concentração do reagente [A]: Velocidade = v = cala] =k[A] At onde [A] = concentração do substrato, t = tempo e k = constante de proporcionalidade designada constante de velocidade (sua unidade é o recíproco do tempo, s !) que depende das condições da reação (temperatura, pH e força iônica). O sinal negativo para as variações da [A] indica que A está sendo consumido na reação. A equação mostra que a velocidade da reação é diretamente proporcional a concentração do reagente A. O processo exibe cinética de primeira ordem (Figura 3.8). Quando a adição de mais reagente não aumenta a velocidade, a reação exibe cinética de ordem zero (Figura 3.8). A expressão da velocidade para a reação A > P é Velocidade = k[A]º =k A velocidade é constante porque não depende da concentração dos reagentes, mas de outros fatores. A quantidade de reagente é o suficiente grande para saturar todos os sítios catalíticos das moléculas enzimáticas. Assim, o reagente só existe na forma de complexos enzima-substrato (ES). Como a curva velocidade-substrato é hiperbólica, a fase de ordem zero atinge uma velocidade máxima, Vonax- a de ordem zero Cinética de primeira ordem Velocidade inicial vo 1 2 3 4 5 6 7 8 Concentração de substrato [8] Figura 3.8 Efeito da concentração do substrato sobre a velocidade inicial (vo) em reações catalisadas por enzimas. Uma reação bimolecular ou de segunda ordem pode ser escrita: A+B>C Sua equação de velocidade é 84 e MOTTA o Bioquímica Velocidade = — ala] =— «Bl =k[AJ[B] O k é a constante de velocidade de segunda ordem e tem como unidade M'!.s!. A velocidade de uma reação de segunda ordem é proporcional ao produto da concentração dos dois reagentes ([A][B]). 3.7 Cinética enzimática O estudo da velocidade das reações enzimáticas ou cinética enzimática, envolve informações indiretas sobre o mecanismo de ação catalítica, especificidade das enzimas, alguns fatores que afetam a velocidade das reações e a determinação quantitativa de seus efeitos. Apesar de catalisarem uma grande variedade de reações por diferentes mecanismos, as enzimas podem ser analisadas quanto as suas velocidades para quantificar as suas eficiências. Quando o substrato S liga o sítio ativo de uma enzima E, um complexo enzima-substrato (ES) é formado em processo rápido e reversível antes da formação do produto. Após um breve tempo, o produto se dissocia da enzima conforme a equação: E+SSESSP onde k, = constante de velocidade para a formação do complexo ES onstante de velocidade para a dissociação de ES em P constante de velocidade para a formação de produto e liberação do sítio ativo. A relação quantitativa entre a velocidade de reação enzimática e a concentração do substrato é definida pela equação de Michaelis-Menten (Leonor Michaelis e Maud Menten em 1913). No desenvolvimento da equação deve-se supor que (1) o k é negligenciável quando comparado com k, e (2) a velocidade de formação de ES é igual a velocidade de sua degradação não sofrendo alterações durante a medida da velocidade (postulado do estado estacionário): Velocidade = 22 - k. [ES] At Para ter utilidade, a velocidade de uma reação deve ser definida em termos de [S] e [E]. A velocidade de formação de ES é igual a k[EJ[S], enquanto a velocidade de dissociação de ES é igual a (k, + k;[ES]. O postulado do estado estacionário iguala as duas velocidades: Ki[EJ[S] = (k» + ks)[ES] Eesl- ts, Michaelis e Menten introduziram uma nova constante, Ky 3 Enzimas é 87 V max, “Eloa ka representa o número de moléculas de substrato convertidos em produto por segundo por molécula de enzima (ou por mol de sítio ativo nas enzimas oligoméricas) sob condições de saturação. Em outras palavras, o Kca indica o número máximo de moléculas convertidas em produto por segundo por cada sítio ativo. [Elia = concentração total da enzima. k Tabela 3.3 — Constantes catalíticas de algumas enzimas Enzima Kent (87) Nuclease estafilicócica 95 Citidina-deaminase 299 Triose-fosfato-isomerase 4.300 Ciclofilina 13.000 Cetoesteróide-isomerase 66.000 Anidrase-carbônica 1.000.000 B. Constante de especificidade (Kça:/Km) A relação ka/Km é chamada constante de especificidade e relaciona a eficiência catalítica da enzima com a sua afinidade pelo substrato. A velocidade da reação varia diretamente com a frequência de colisões entre as moléculas de enzima e as de substrato na solução. A decomposição do complexo ES em E + P não pode ocorrer mais velozmente que o encontro de E e S para formar ES. A relação kca/Km é, em geral, o melhor parâmetro cinético para comparações de eficiência catalítica entre diferentes enzimas. Valores baixos da relação indicam pouca afinidade da enzima pelo substrato. Por exemplo, a acetilcolinoestarase tem valor de kca/Km de 1,5 x 10º sm mostrando alta eficiência, enquanto a urease o valor é 4 x 10º s'M! descreve uma menor eficiência. Tabela 3.4 — Constante de especificidade, kca:/Km, de algumas enzimas Enzima Hal Km (5!) Acetilcolinesterase 1.6x 10º Anidrase-carbônica 83x 107 Catalase 4x 107 Crotonase 28x 10º Fumarase 1.6x 10º é Triose-phosphate-isomerase 2410 1108 B-Lactamase 710º Superoxide-dismutase 88 e MOTTA o Bioquímica C. Gráfico de Lineweaver-Burk Os valores do Km e da Vmax de uma enzima são determinados pela medida das velocidades iniciais para várias concentrações de substrato. Pela construção do gráfico mostrado na Figura 3.6 só é possível calcular valores aproximados de Km e da Vmax A determinação mais acurada desses valores é possível pela modificação algébrica da equação de Michaelis-Menten: Vime [8] Km +I|S utilizando o inverso da equação: E y—+ Vo Vias [8] Vias A representação gráfica da recíproca de velocidade inicial, 1/vo, versus a recíproca da concentração do substrato, 1/[S], fornece uma linha reta com inclinação Km/Vmax em um gráfico duplo-reciproco ou Lineweaver-Burk. O ponto onde essa linha intercepta a ordenada é igual a 1/Vmax € O ponto de intersecção na abscissa é igual a-1/Km (Figura 3.10). A utilização do gráfico permite calcular com precisão Vmax € Km pela medida da inclinação e do intercepto. Ly Inclinação = K/Vmas 4 NVimax -1/Km o Ms] Figura 3.10 Determinação da Vmx e Km à partir do gráfico duplo-recíproco de Lineweaver-Burk. O gráfico 1/Vo versus 1/[S] derivado de medidas das velocidades iniciais em várias concentrações diferentes de substratos. A linha reta obtida pela ligação de pontos individuais é ampliada para interceptar a ordenada e abscissa. Os valores de Ky € Vmar São determinados pela medida das inclinações e intersecções. D. Reações com multissubstratos Mais da metade das reações bioquímicas envolvem dois substratos, em lugar de reações simples com um único substrato e que 3 Enzimas e 89 obedecem o modelo de Michaelis-Menten. As reações com multissubstratos podem proceder por diferentes mecanismos: 1. Mecanismo ordenado. Os substratos, S, e S,, devem associar-se à enzima com uma ordem obrigatória antes que a reação possa ocorrer. A ligação do primeiro substrato é necessária para que a enzima forme o sítio de ligação para o segundo substrato. Muitas desidrogenases nas quais o segundo substrato é uma coenzima (NAD”, FAD etc.) são exemplos desse mecanismo. 2. Mecanismo aleatório. Os dois substratos, S; e S,, podem se ligar à enzima em qualquer ordem. A hexocinase transfere um grupo fosfato do ATP para a glicose por esse mecanismo, apesar da glicose tender ligar inicialmente a molécula de ATP. 3. Reações de dupla-troca (pingue -pongue). Um ou mais produtos são liberados antes que os outros substratos se liguem à enzima modificada. As reações catalisadas pela UDP-glicose-l fosfato uridiltransferase, piruvato-carboxilase e acetil-CoA-carboxilase são exemplos desse mecanismo. 3.8 Inibição enzimática Inibidores são substâncias que reduzem a atividade das enzimas e incluem fármacos, antibióticos, preservativos de alimentos e venenos. São importantes por várias razões: (1) Os inibidores enzimáticos atuam como reguladores das vias metabólicas. (2) Muitas terapias por fármacos são baseadas na inibição enzimática. Por exemplo, muitos antibióticos e fármacos reduzem ou eliminam a atividades de certas enzimas. O tratamento da AIDS inclui inibidores das proteases, moléculas que inativam a enzima necessária para produzir novos vírus. (3) Desenvolvimento de técnicas para demonstrar a estrutura física e química, e as propriedades funcionais das enzimas. Distinguem-se dois tipos de inibição: reversível e irreversível, segundo a estabilidade da ligação entre o inibidor e a molécula de enzima. Na inibição reversível ocorre interações não-covalentes entre o inibidor e a enzima, enquanto na inibição irreversível envolve modificações químicas da molécula enzimática, levando a uma inativação definitiva. Na inibição reversível, a enzima retoma sua atividade após dissociação do inibidor. Três classes de inibidores reversíveis são descritos: competitivo, | não-competiti incompetitivo. 92 e MOTTA o Bioquímica Y O Sem inibidor * Inúbidor não- competitivo Não inibida Km = 15] Figura 3.12 Inibição não-competitiva. A. Efeito da concentração do substrato sobre a velocidade inicial na presença de um inibidor não-competitivo. B. Gráfico de Lineweaver-Burk para a reação mostrada em A. C. Ini ção incompetitiva O inibidor incompetitivo liga-se apenas ao complexo ES da enzima originando um complexo inativo, ESI. O inibidor não se combina com a enzima livre. E+S SES+IS EIS > Não há reação A inibição não é revertida pelo aumento na concentração do substrato. O resultado é a modificação aparente do Km € Vmax (Figura 3.14). Sem inibidor v, max Inibida vt. + Inibidor competitivo | Não inibida Esi TAS] Km Km (Anibido) (Fnibido) Figura 3.13 Gráfico de Lineweaver-Burk para um inibidor incompetitivo. D. Inibição irreversível A inibição irreversível envolve modificação covalente e permanente do grupo funcional necessário para a catálise, tornando a enzima inativa. E classificado como um inativador. Alguns pesticidas inibem o sítio ativo da acetilcolina-esterase, o que impede a hidrólise 3 Enzimas é 93 da acetilcolina na sinapse, resultando, no homem, paralisia dos músculos respiratórios e edema pulmonar. ores enzimáticos E. Fármacos que atuam como ini Muitos fármacos modernos atuam como inibidores da atividade enzimática. Esse mecanismo é encontrado com antivirais, antitumorais e antibacterianos. Os compostos com diferentes estruturas em relação ao substrato natural que atuam como inibidores são conhecidos como antimetabólitos. Entre os quais citam-se, as sulfas (a sulfanilamida compete com o ácido p-aminobenzóico necessário para o crescimento bacteriano), o metotrexato (compete com o diidrofolato e é usado no tratamento da leucemia infantil), substratos suicidas (geram uma espécie altamente reativa que reage de forma irreversível com o sítio ativo, exemplo, o Omeprazol usado no tratamento de excessiva acidez estomacal), fluorouracil (inibidor irreversível da timidilato-sintetase) e 6-mercaptopurina (compete com a adenina e guanina e é efetiva no tratamento de leucemias infantis). 3.9 Regulação da atividade enzimática Além da influência exercida sobre a atividade enzimática de diversos fatores, tais como: concentração do substrato e enzima, pH, temperatura e presença de co-fatores, tem-se também, a integração das enzimas nas vias metabólicas e a interrelação dos produtos de uma via com a atividade de outras vias. As vias metabólicas não operam em capacidade máxima o tempo todo. De fato, muitos processos podem ser interrompidos, inibidos ou ativados, durante certas fases no ciclo de vida da célula. Se assim não fosse, a célula teria um crescimento descontrolado e antieconômico. A regulação das vias metabólicas ocorre por meio da modulação da atividade de uma ou mais enzimas-chave do processo. A etapa de maior energia de ativação é denominada etapa de comprometimento (geralmente uma reação irreversível). Comumente, enzima-chave que catalisa a etapa comprometida serve como válvula de controle do fluxo de moléculas no percurso metabólico. 94 e MOTTA o Bioquímica Quadro 3.5 Inibidores irreversíveis Inibidores enzimáticos irreversíveis são Outro exemplo de inibidor irreversível é a geralmente substâncias tóxicas. Podem ser aspirina (ácido acetil-salicílico), porém com substâncias naturais ou sintéticas. propriedades — farmacológicas (antiinflamatório, Os compostos organofosforados como o antipirético e analgésico). A aspirina transfere diisopropilfosfofluoridato (DIFP), formam ligações irreversivelmente seu grupo acetil para o grupo OH covalentes com o grupo OH de resíduos de serina de um resíduo de serina da molécula de 195 da acetilcolinesterase (enzima que catalisa a cicloxigenase, inativando-a. Essa enzima é hidrólise da acetilcolina), inativando-a. A responsável pela catálise da primeira reação da iodoacetamida, reage com o grupo SH de resíduos de sintese de prostaglandinas (substâncias reguladoras cisteína. Esses inibidores são bastante tóxicos para de muitos processos fisiológicos). os organismos, não só pela irreversibilidade de sua A penicilina liga-se especificamente às enzimas ligação às enzimas, mas também devido à sua da via de síntese da parede bacteriana, inibindo-as inespecificidade. irreversivelmente. A regulação das vias bioquímicas envolve mecanismos sofisticados e complexos. É conseguida principalmente pelo ajuste das concentrações e atividades de certas enzimas. O controle é atingido por: (1) controle genético, (2) modificação covalente, (3) regulação alostérica e (4) compartimentalização. A. Controle genético A quantidade das enzimas disponíveis nas células depende da velocidade de sua síntese e da velocidade de sua degradação. A síntese de enzimas em resposta às mudanças das necessidades metabólicas é um processo conhecido como indução enzimática, que permite a resposta celular de maneira ordenada às alterações no meio. A síntese de certas enzimas pode ser especificamente inibida por repressão. O produto final de uma via bioquímica pode inibir a síntese de uma enzima-chave da mesma via. B. Regulação por modificação covalente A atividade de algumas enzimas que modulam o fluxo das vias metabólicas, é regulada por modificações covalentes reversíveis, em reações catalisadas por outras enzimas. Isso resulta na ativação ou inibição da atividade enzimática. Frequentemente, a modificação envolve a fosforilação e defosforilação da enzima por adição ou remoção de grupos fosfato ou, por modificações covalentes de outro tipo. As fosforilação e defosforilação são catalisadas por proteinas-cinases e proteinas-fosfatases, respectivamente. Como exemplo do processo regulador, tem-se a enzima glicogênio fosforilase que catalisa o desdobramento do glicogênio. A enzima se apresenta na forma fosforilada (ativa) e desfosforilada (inativa) em processo de interconversão cíclica entre as duas formas. O mecanismo geral de regulação por modificação covalente está intimamente associado à ação hormonal. 3 Enzimas é 97 aumenta nos dois protômeros. Um efetor negativo diminui a afinidade pelo substrato nos dois protômeros. Dois modelos explicam o comportamento de enzimas alostéricas com curvas sigmoidais vo versus [S] que refletem as interações cooperativas entre as subunidades oligoméricas: 1. Modelo concertado (ou de simetria). Proposto por Monod, Wyman e Changeux, onde as subunidades estão todas na forma inativa (T, tenso) ou todas na forma ativa (R, relaxado). Os estados T e R estão em equilíbrio. Ativadores e substratos favorecem o estado R. Inibidores favorecem o estado T. Uma mudança conformacional num protômero causa uma mudança correspondente em todos os protômeros. 2. Modelo seqiiencial. Proposto por Koshland, Némethy e Filmer as subunidades podem sofrer a mudança conformacional individualmente. A ligação do substrato aumenta a probabilidade da mudança conformacional. A mudança em uma subunidade faz ocorrer uma mudança similar na subunidade adjacente, vizinho do protômero contendo o ligante unido, assim como torna mais provável a ligação de uma segunda molécula de substrato. Modelo segiencial 29-85-8588 P Estado T Q EstadoR E Substrato Modelo concertado co Figura 3.16 Comportamento das enzimas alostéricas. No modelo concertado, todas as unidades são convertidas do estado T (baixa afinidade) para o estado R (alta afinidade) simultaneamente. No modelo sequencial, as subunidades sofrem mudanças conformacionais progressivamente com as ligações do substrato. Muitas enzimas são sintetizadas como precursores inativos e, subsequentemente, ativadas pela clivagem de uma ou mais ligações peptídicas específicas. O precursor inativo é chamado zimogênio (ou proenzima). Não é necessária uma fonte de energia (ATP) para a clivagem. 98 e MOTTA o Bioquímica As formas zimogênios são geralmente designadas pelo sufixo -ogênio depois do nome da enzima; a forma zimogênio da quimotripsina é denominada quimotripsinogênio. Algumas vezes, a forma zimogênio é referida pró-enzima; a forma zimogênio do colágeno é o pro-colágeno. A proteólise específica é um meio comum de ativação de enzimas e outras proteínas nos sistemas biológicos. Exemplos: e As enzimas digestivas que hidrolisam proteínas são sintetizadas como zimogênios no estômago e pâncreas (Quadro 3.3). e A coagulação sangúínea é mediada por uma cascata de ativadores proteolíticos que asseguram uma rápida e amplificada resposta a lesão celular. Os zimogênios são sintetizados nas células do fígado e são secretados no sangue para subsequente ativação por serino-proteases. e Alguns hormônios protéicos são sintetizados como precursores inativos. Por exemplo: a insulina é derivada da pró-insulina pela remoção proteolítica de um peptídeo. e A proteína fibrosa colágeno, o maior constituinte da pele e ossos, é derivado do pro-colágeno, um precursor solúvel. e Muitos processos de desenvolvimento são controlados pela ativação de zimogênios. Por exemplo, parte do colágeno é desdobrado no útero dos mamíferos após o parto. A conversão da pró-colagenases em colagenases, a protease ativa, é realizado no momento apropriado dentro do processo. e A apoptose ou a morte celular programada é mediada por enzimas proteolíticas denominadas captases e sintetizadas na forma de precursor pró-caspases. Quando ativadas por vários sinais, as caspases atuam na morte celular. A apoptose promove um meio de esculpir as formas de parte do corpo no curso do desenvolvimento e um meio de eliminar células produtoras de auto-anticorpos ou infectadas com patógenos também como, células contendo uma grande quantidade de DNA lesado. Quadro 3.3 - Zimogênios gástricos e pancreáticos Local de síntese Zimogênio Enzima ativa Estômago Pepsinogênio Pepsina Pâncreas Quimiotripsinogênio Quiniotripsina Páâncreas Tripsinogênio Tripsina Pâncreas Pró-carboxipeptidase Carboxipeptidase Pâncreas Proelastase Elastase E. Isoenzimas Outro fenômeno de regulação metabólica e que depende da estrutura quaternária das proteínas enzimáticas são as isoenzimas. As isoenzimas ou isozimas são formas moleculares múltiplas de uma 3 Enzimas e 99 enzima, que realizam a mesma ação catalítica e ocorrem na mesma espécie animal. O exemplo clássico é a lactato-desidrogenase (LDH) um tetrâmero formado por duas espécies diferentes de cadeias polipeptídicas, denominadas M (músculo) e H (coração). Essas subunidades são codificadas por genes diferentes. A combinação das duas cadeias produz cinco isoenzimas que podem ser separadas eletroforeticamente (Quadro 3.4). Quadro 3.4 — Composição das subunidades da lactato-desidrogenase e suas principais localizações Tipo Composição Localização LDHA HHHH Miocárdio e eritrócitos LDH-2 HHHM Miocárdio e eritrócitos LDH-3 HHMM Cérebro e figado LDH-4 HMMM - LDH-S MMMM Músculo esquelético e fígado A lactato desidrogenase catalisa a redução reversível do piruvato a lactato. Desse modo, no músculo esquelético a isoenzima LDH-S apresenta Va elevada para o piruvato e, portanto, converte rapidamente o piruvato a lactato. No caso da LDH-1, encontrada no coração a Vmax é relativamente baixa para o piruvato, não favorecendo a formação do lactato. O excesso de piruvato inibe a isoenzima LDH-1. O músculo cardíaco, um tecido essencialmente aeróbico, metaboliza a glicose a piruvato e, a seguir, a CO, e H50O, produzindo pouco lactato. Entretanto, em situações de déficit de oxigênio, o piruvato pode ser convertido a lactato como medida de emergência. Assim, as características cinéticas distintas das duas enzimas determinam o tipo de metabolismo em cada tecido. Foram estudadas isoenzimas de várias enzimas diferentes, sendo as mais importantes, do ponto de vista clínico, além da lactato desidrogenase, a creatina cinase e a fosfatase alcalina. 3.10 Aplicações clínicas das enzimas Muitas das enzimas presentes no plasma, líquido cefalorraquidiano, urina e exudatos, são provenientes, principalmente, do processo normal de destruição e reposição celular. Entretanto, certas enzimas se apresentam, nesses líquidos, em teores elevados após lesão tecidual provocadas por processos patológicos com o aumento na permeabilidade celular ou morte prematura da célula. Nos casos de alteração da permeabilidade, as enzimas de menor massa molecular aparecem no plasma. Quanto maior o gradiente de concentração entre os níveis intra e extracelular, mais rapidamente a enzima difunde para fora. As enzimas citoplasmáticas surgem no plasma antes daquelas presentes nas organelas sub-celulares. Quanto maior a extensão do tecido lesado, maior o aumento no nível plasmático. As enzimas não específicas do plasma