Noções Gerais Sobre Ciência Forense

Noções Gerais Sobre Ciência Forense

(Parte 5 de 8)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

A técnica mais usada para o estudo do DNA é a PCR. Esta técnica foi descrita por Kary Mullis, em 1985 e baseia-se na amplificação enzimática in vitro de um fragmento de DNA de interesse (target) que é flanqueado por 2 "primers" que hibridam com as extremidades 3 da dupla cadeia. Ciclos repetidos, consistindo na desnaturação do DNA, "annealing" dos "primers" e sua extensão, originam em cada ciclo a duplicação da sequência inicial, correspondendo a um crescimento exponencial da referida sequência. Isto é, decorridos 20 ciclos, o DNA em estudo, delimitado pelos "primers", cuja sequência de bases foi previamente seleccionada, estará amplificado cerca de 1 milhão de vezes. Cada um dos referidos ciclos inclui as seguintes fases:

1ª- Desnaturação da sequência de DNA que se pretende estudar (± 90ºC) 2ª- “Annealing” dos “primers” (± 60ºC)

3ª- Extensão dos “primers” (± 72ºC), graças à Taq polimerase e aos nucleótidos trifosfatados (DNTPs – dATP, dTTP, dGTP e dCTP).

A automatização do processo, com a utilização dos termocicladores, proporcionou a simplificação de todo o procedimento, constituindo também uma importante inovação. O uso da técnica de PCR requer que, pelo menos, seja conhecida a sequência de DNA que rodeia a região de interesse, para ser possível a construção dos "primers" usados na amplificação. Conhecendo-se a referida sequência, é possível escolher os "primers" por forma a permitirem a delimitação directa do local polimórfico.

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Actualmente, são vários os polimorfismos de DNA com interesse médico-legal, que podem ser estudados por PCR, como polimorfismos de sequência, AMPFLPs e loci STR. No entanto, actualmente, só são usados estes últimos. Das vantagens desta técnica, destaca-se o facto da PCR possuir a capacidade para efectuar a análise de uma determinada sequência numa amostra exígua de DNA, qualquer que seja a sua quantidade e qualidade, desde que a amostra tenha, pelo menos, uma cadeia de DNA intacta, rodeando a região a ser amplificada. Esta sensibilidade, segundo vários autores, tem permitido a tipagem de diferentes polimorfismos de DNA de um único cabelo, de um espermatozóide e de células somáticas individuais. Outros autores referem ter efectuado reacções de amplificação em DNA degradado de tecidos guardados em arquivo e fixados em formol ou embebidos em parafina, ou ainda, extraídos de peças antigas existentes em museus ou achados arqueológicos. Por tudo o que foi anteriormente referido, poder-se-á afirmar que a técnica de PCR se tornou um meio precioso para a análise de regiões polimórficas, em amostras de DNA humano, particularmente em criminalística, nos quais raramente se dispõe de DNA de alto peso molecular em quantidades apreciáveis. Trata-se de uma metodologia muito usada na resolução de casos médico-legais, sendo também utilizada no diagnóstico clínico e noutros ramos da ciência.

Sistemas AMPFLPs e STRs estudados por PCR

Sistemas AMPFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms) são os loci VNTR, cujos alelos possuem tamanhos moleculares, aproximadamente, de 100 a 2000 pb. Os dois grupos de sistemas, AMPFLPs e STRs, em virtude do curto tamanho dos seus alelos, são susceptíveis de amplificação por PCR e visualização directa dos produtos de amplificação, embora, actualmente, apenas se usem os últimos.

Loci STR estudados por PCR

Os loci microsatélite podem definir-se como pequenas sequências de DNA (com menos de 350 pb), dispersas pelo genoma, repetidas em tandem, de 2 a 7 pb de tamanho, pelo que também são conhecidos por loci STR (Short Tandem Repeats). Calculou-se que o genoma humano contém, aproximadamente, 500.0 STRs, dos quais 6.0 a 10.0 são tri ou tetraméricos. Um grande número destes loci apresenta um elevado grau de polimorfismo genético, cuja base molecular consiste na variação do número de unidades de repetição. Estes sistemas, devido à sua abundância no genoma humano, ao seu elevado grau de polimorfismo e à possibilidade de serem facilmente estudados mediante técnicas de PCR, converteram-se nos marcadores de eleição em vários campos da ciência, designadamente na identificação genética humana.

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É para notar, que o estudo dos loci STR proporciona uma maior sensibilidade, devido ao pequeno tamanho dos produtos de amplificação permitindo, por conseguinte, uma amplificação mais eficaz em amostras degradadas.

É possível, no caso dos STRs, proceder-se à amplificação simultânea de vários loci numa única mistura de reacção (PCR multiplex), podendo-se fazer a análise conjunta dos produtos amplificados. Tal facto, proporciona o aumento do poder de discriminação e a diminuição do tempo de análise, bem como das quantidades de DNA e de reagentes a usar. Os STRs são claramente identificáveis, permitindo a distinção de alelos que diferem apenas num nucleótido. Tal facto torna viável a comparação dos resultados obtidos por diferentes laboratórios. É aconselhável a estandardização das condições experimentais (composição do gel, electroforese) e o uso de padrões alélicos consenso adequados e de sequência conhecida, assim como a uniformidade na nomenclatura empregue na classificação dos alelos. Em casos pontuais e excepcionais em que exista dúvidas relativamente a estes aspectos, podese proceder à sequenciação dos alelos considerados duvidosos. Actualmente, estes problemas estão praticamente ultrapassados com o uso de kits comerciais, porquanto estes possuem os produtos e condições perfeitamente estandardizados para o estudo de uma grande gama de sistemas STR. Assim, por exemplo a Perkin-Elmer está a comercializar kits, como o Profiler Plus e o SGM Plus que permitem o estudo da amelogenina (gene homólogo do cromossoma X e Y) e de, respectivamente, os seguintes sistemas: D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820 e D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA. Importa sublinhar que, após a reacção de PCR, os produtos de amplificação têm de ser analisados, usando-se para esse fim várias metodologias sendo, todavia, a mais divulgada e a que oferece resultados mais fiáveis a que utiliza sequenciadores automáticos, pelas razões adiante expostas.

Uso dos sequenciadores automáticos para o estudo dos STRs

A utilização de sequenciadores automáticos é hoje praticamente imprescindível como tecnologia associada à PCR, tanto na análise de loci STR, como no próprio estudo da sua sequência, nos casos em que, por exemplo, se torna necessário o esclarecimento da presença de uma mutação genética ou, ainda, na análise do DNA mitocondrial que pressupõe a sequenciação de duas regiões hipervariáveis (HVI e HVII). Estes permitem que a informação electroforética se vá armazenando à medida que decorre a migração, graças à utilização de um software apropriado, sendo os alelos detectados por laser,

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Medicina Legal / Noções Gerais sobre outras ciências forenses pois os “primers” usados são marcados com fluorescência. Para além de que, paralelamente à migração das amostras de DNA em estudo, migram vários padrões externos (“sizer” externo) e padrões internos adicionados a todas as mostras a estudar (“sizers” internos). Os referidos padrões são reconhecidos pelo software e servem para construir curvas de calibração, eliminando as diferenças de mobilidades electroforéticas que podem existir em diferentes “lanes”. Deste modo, é possível eliminar automaticamente as variações da mobilidade electroforética, as quais podiam conduzir a uma tipagem errada dos alelos. Com um sequenciador é possível a tipagem simultânea de vários sistemas, pelo que é necessária uma quantidade inferior de DNA molde, o que constitui uma grande vantagem na resolução de casos com interesse forense em que se dispõe de pequenos vestígios, com quantidades exíguas de DNA. A Perkin-Elmer possui vários modelos de sequenciadores automáticos, dos quais podemos destacar o modelo ABI 310 e o ABI 3100 (electroforese capilar), que possuímos no nosso laboratório que, para além das vantagens atrás expostas, possibilitam o estudo de vários sistemas, designadamente loci STR, em que se verifique a sobreposição do tamanho dos alelos, porque os distintos primers, para amplificação de cada sistema, são marcados com diferentes fluorocromos, ou seja, com cores diferentes. Estes sequenciadores usam a electroforese capilar, em vez dos geis de poliacrilamida utilizados noutros modelos, obviando a preparação e manipulação do gel o que, muitas vezes, representava muito trabalho laboratorial, até porque nem sempre os geis tinham a qualidade requerida para que se obtivesse bons resultados. A electroforese capilar, entre outras vantagens, possui uma grande sensibilidade que é de grande interesse, especialmente quando a quantidade de produto amplificado é exígua. Por isso, de uma maneira geral, o uso dos sequenciadores apresenta muitas vantagens relativamente aos processos manuais, designadamente o facto de obviar a necessidade da manipulação do gel, após a electroforese, para a detecção dos produtos de PCR, ao contrário do que ocorre quando a técnica empregue não é automática, em que é necessária a exposição autorradiográfica do gel ou a coloração com nitrato de prata. Outra vantagem a registar é o facto da análise dos resultados ser também automatizada, através da utilização de software adequado, permitindo armazenar os dados em bases de dados, para posteriores análises estatísticas. Os sinais de fluorescência são conhecidos por serem lineares num maior grau de intensidades do que as autorradiografias convencionais. Por isso, estes sistemas de detecção são, provavelmente, mais úteis para a quantificação directa dos produtos de PCR. Este facto revela-se de especial interesse quando se possui mistura de amostras provenientes de mais de um indivíduo, pois o tamanho dos picos obtidos dá uma ideia do material celular existente de cada indivíduo, por exemplo, nos casos de violação.

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DNA Mitocondrial e Cromossoma Y A análise do DNA mitocondrial e do cromossoma Y, permite determinar relações familiares, quando existe um hiato de várias gerações entre um ancestral e descendentes vivos. No entanto, não possuem o poder de discriminação dos sistemas autossómicos, designadamente dos loci STR autossómicos do DNA nuclear, para além de que é necessária uma maior ponderação na elaboração das conclusões. Num futuro próximo, com a criação de um número suficiente de bases de dados, com o desenvolvimento de novas metodologias e, possivelmente, também de novas técnicas, bem como com um perfeito controlo das situações excepcionais, cuja conclusão pode levantar algumas dúvidas de interpretação, o estudo do cromossoma Y e do DNA mitocondrial pode constituir uma peça relevante na resolução de perícias médico-legais do âmbito da Biologia Forense.

Conclusões

Investigação da paternidade Prova positiva de paternidade

Nos casos da prova positiva de paternidade, isto é, quando não se verificar a existência de exclusão de paternidade por nenhum dos sistemas estudados, calcula-se a probabilidade de paternidade, com base no Teorema de Bayes. Este teorema é usado para determinar a probabilidade final de um sucesso, deduzida a partir das probabilidades iniciais e certa informação ou informações adicionais. A fórmula que expressa a probabilidade (a posteriori) de paternidade contém um parâmetro para poder ser simplificada, que é a probabilidade a priori de paternidade. Assim, se se atribuir a este valor de probabilidade 0.5, considerando que o pretenso pai tem tanta probabilidade de ser o pai como de não ser, surge uma fórmula simplificada:

Também conhecida por equação de Essen-Möller (1938), em que W é a probabilidade de paternidade, X é a probabilidade de que o pai biológico seja o pretenso pai ou probabilidade de que se verifique a paternidade e Y é a probabilidade de que o pai biológico seja um indivíduo tirado ao acaso da população ou probabilidade de não paternidade.

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Para além do valor de probabilidade de paternidade, também são usados outros parâmetros, como o índice de paternidade, que é o cociente X

Y e ainda o valor EM (Essen-Möller), que é dado pela expressão: log Y/X+10. Nas conclusões dos relatórios de investigação de paternidade em que não se verifique exclusão de paternidade por nenhum dos sistemas estudados deve ser indicado o valor da probabilidade de paternidade. Para que esses resultados sejam facilmente entendíveis por parte dos juristas, deve ser anexada a Tabela de Hummel. Nessa tabela para intervalos de valores de probabilidade de paternidade são atribuídos predicados verbais. Actualmente, usa-se a tabela de Hummel modificada em que apenas figuram valores de probabilidade de paternidade superiores a 9%, pois com as novas tecnologias empregues é pouco provável não se atingir este valor.

Tabela de Hummel modificada Probabilidade de Paternidade Predicado verbal

W ≥ 9.73% Paternidade praticamente provada

9.73% > W ≥ 9% Paternidade extremamente provável

Exclusão de paternidade

Quando se caracterizam laboratorialmente os diferentes polimorfismos que constituem a prova pericial, pode ocorrer que se encontre exclusão por um sistema, várias exclusões ou nenhuma. Todavia, nem todos os tipos de exclusão têm o mesmo valor. Assim, classicamente, concluía-se por exclusão de paternidade, quando houvesse exclusão pelo menos por dois sistemas, sendo uma delas de 1ª ordem (directa ou pela 1ª regra de Landsteiner). Os casos mais frequentes de exclusão de 1ª ordem para um dado sistema ocorrem, quando o filho possui um alelo ausente na mãe e no pretenso pai ou quando o pretenso pai é heterozigótico e o filho não possui nenhum dos seus alelos. É para notar que apenas existe exclusão de 1ª ordem aparente, quando houver um erro técnico ou quando existir uma mutação, contudo, a taxa de mutação geral para a espécie humana é baixa. Actualmente, devido ao uso de marcadores genéticos, concretamente de STRs, com taxas de mutação relativamente elevadas, as regras, previamente usadas, para se concluir um caso por exclusão de paternidade devem ser suficientemente ponderadas e avaliadas caso a caso, sendo aconselhável, nalgumas situações, a sequenciação dos alelos dos sistemas que proporcionam a exclusão.

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As exclusões de 2ª ordem (indirectas ou pela 2ª regra de Landsteiner) são aquelas em que pode existir a possibilidade de erro, ou seja, a exclusão aparente de paternidade, quando para o sistema em questão existem alelos silenciosos ou que se comportem como tal. O caso mais frequente deste género de exclusões ocorre quando o pretenso pai e o filho são homozigóticos para alelos diferentes. Há alguns anos entendia-se que só se podia concluir com certeza os casos de exclusão de paternidade. Hoje, dado o avanço da ciência neste campo, considera-se que um resultado positivo de paternidade, devidamente documentado, é mais seguro do que o da exclusão de paternidade apenas por dois marcadores genéticos. Por outro lado, o antigo argumento usado pela defesa de que pode existir um indivíduo geneticamente igual ao pretenso pai, tem cada vez menos valor. Pois, um resultado de paternidade próximo de 9.9% pressupõe a utilização de um conjunto de sistemas suficientemente alargado, pelo que na prática, não será possível encontrar um indivíduo geneticamente igual ao pretenso pai, com excepção dos gémeos monozigóticos.

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