Baixe Teoria cromatografia - Apostilas - Biologia Parte1 e outras Notas de estudo em PDF para Biologia, somente na Docsity! CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo CaCO3 m istura de pigmentos pigmentos separados Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego) Adaptado do original: QFL2242 Prof. Fábio Augusto - Unicamp Marina F. M. Tavares CROMATOGRAFIA Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). CROMATOGRAFIA GASOSA Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG ? Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”) (para uma substãncia qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve ser dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gás) DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que termicamente estáveis. O Cromatógrafo a Gás 1 2 3 4 6 5 1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). Observação: em vermelho: temperatura controlada INSTRUMENTAÇÃO Gás de Arraste Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amos- tra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE Requisitos: INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidroliza algumas FE incompatíveis com DCEH2O, O2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC INSTRUMENTAÇÃO Dispositivos de Injeção de Amostra Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica Injeção instantânea: Injeção lenta: t = 0 t = x t = 0 t = x INSTRUMENTAÇÃO Injetor “on-column” Convencional 1 2 3 4 1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica INSTRUMENTAÇÃO Injeção “on-column” de líquidos 1 2 3 1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna. 3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna. INSTRUMENTAÇÃO Colunas: Definições Básicas EMPACOTADA ∅ = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pul- verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR ∅ = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recober- tas com um filme fino (fra- ção de µ m) de FE líquida ou sólida INSTRUMENTAÇÃO Temperatura da Coluna Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0). p0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDA- MENTE (MENOR RETENÇÃO) INSTRUMENTAÇÃO Temperatura da Coluna TEM PER A TU R A D A C O LU N A CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos volá- teis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos TCOL ALTA: - Componentes mais volá- teis não são separados - Componentes menos volá- teis eluem mais rapidamente INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TEMPO TE M PE R AT U R A tINI tFIM TINI TFIM R Parâmetros de uma programação de temperatura: TINI Temperatura Inicial TFIM Temperatura Final tINI Tempo Isotérmico Inicial tFIM Tempo Final do Programa R Velocidade de Aquecimento INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidade vazão DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida TEORIA BÁSICA Tempo de Retenção Ajustado, tR‘ tR tM tR’ = tR - tM TEMPO SI N A L tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in- jeção e o ápice do pico cromatográfico) tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE) O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’: TEORIA BÁSICA Volume de Retenção Ajustado, VR‘ Embora não diretamente mensurável, o parâ- metro fundamental de retenção é o VOLUME DE RETENÇÃO AJUSTADO, VR’: vazão do gás de arraste MRR ttt TEORIA BÁSICA Constante de Distribuição, KC Coluna cromatográfica: série de estágios inde- pendentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e no gás de arraste: Ocorre um “quase-equilíbrio” en- tre o analito sorvido na FE e dis- solvido no gás de arraste. SA TEORIA BÁSICA Relações entre VR’, KC e β VR’ pode ser definido em função de KC e β: VR’ depende diretamente da constante de dis- tribuição do soluto entre a FE e o gás de arraste e das dimensões da coluna. Outra combinação possível: É possível estimar tanto o fator de retenção quanto a constante de distribuição a partir do cromatograma TEORIA BÁSICA Eficiência de Sistemas Cromatográficos A migração um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:TEMPO Efeitos do alargamento excessivo de picos: Separação deficiente de analitos com retenções próximas. Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.