Mutagênese - Apostilas - Engenharia Agronômica, Notas de estudo de Agroflorestal

Baixe Mutagênese - Apostilas - Engenharia Agronômica e outras Notas de estudo em PDF para Agroflorestal, somente na Docsity! UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO DISCIPLINA BMB163 - BIOFÍSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGÊNESE APOSTILA Ana Beatriz Furlanetto Pacheco Wanda M. Von Krüger Luis Carlos S. Ferreira 1 ÍNDICE Mutações – Conceito e introdução 2 Classificações das Mutações 3 A origem das mutações (mutações espontâneas e induzidas) 5 Mutações espontâneas 5 Mutações induzidas 10 Mutagênese mediada por elementos de transposição 13 O que são elementos de transposição 13 Tipos de mutação gerados por elementos de transposição 16 Aplicações experimentais da mutagênese 18 Como gerar e detectar mutantes em laboratório 18 Sistemas para detectar mutantes 18 Técnicas para gerar mutações 19 Mutagênese generalizada 19 Mutagênese sítio específica ou dirigida 20 Técnicas de mutação dirigida 21 Engenharia de proteínas 23 Alteração da estabilidade da proteína 23 Alteração da atividade enzimática 25 Bibliografia 26 Estudos dirigidos 27 4 . mutações sem sentido – troca de um códon que codifica um aminoácido por um códon de parada (UAG, UAA, UGA), . mutações neutras – troca de um aminoácido por outro de propriedades semelhantes sem comprometimento da função da proteína codificada; . mutações silenciosas - troca de bases sem uma correspondente troca de aminoácido. Pergunta 6: O genoma de qualquer organismo é formado por regiões transcritas e não transcritas. Que efeitos podem ter as mutações que incidam nestes locais? Pergunta 7: Que efeito as mutações de troca de base que incidam sobre regiões não transcritas podem trazer sobre a síntese de proteínas específicas? As mutações pontuais podem envolver perda ou ganho de um ou poucos pares de base na seqüência do genoma. Quando esse tipo de mutação ocorre em um gene estrutural e gera a inserção ou deleção de pares der bases nitrogenadas em número diferente de três ou múltiplo de três, temos as chamadas mutações de troca de referencial de leitura ou “frameshift”. A mudança no referencial de leitura é gerada a partir do ponto em que ocorreu a mutação, resultando em uma seqüência de aminoácidos diferente da original na proteína correspondente (Fig. 3). Figura 2 - Mutações pontuais que ocorram em um gene estrutural podem ser classificadas de acordo com o efeito sobre a proteína sintetizada sem sentido sentido trocado neutra silenciosa Figura 3 -Efeito de mutação do tipo troca de referencial de leitura na síntese da proteína codificada. A menos que a mutação ocorra próximo ao final da região codificante do gene, é de se esperar que a proteína resultante perca a sua função, já que sua seqüência será em grande parte alterada. Também pode ocorrer que uma mutação de troca de referencial gere um códon de término prematuro e, portanto, a proteína mutante terá um tamanho bem menor que a original e provavelmente não terá função. 5 Pergunta 8: O que ocorreria nos casos em que ocorre adição ou deleção de bases em número de três ou múltiplo de três? Os rearranjos envolvem um grande número de bases e, freqüentemente, vários genes. Os rearranjos mais comuns são as inserções (adição de material genético como transposons e seqüências de inserção), deleções (perda de fragmentos contínuos de DNA), amplificações (duplicações ou multiplicações de genes) e translocações (transposição de um gene ou genes para locais diferentes no genoma). Como os rearranjos afetam muitos genes, podem interferir na expressão de varias proteínas. Pergunta 10: Em que situação a inversão de um gene estrutural pode levar à interrupção da produção da proteína codificada? A origem das mutações (mutações espontâneas e induzidas) Mutações espontâneas As mutações podem ser classificadas quanto à origem em: mutações espontâneas e mutações induzidas. Em uma população de células, mutações aparecem espontaneamente numa taxa que varia de 10-6 a 10-8 por geração, dependendo do organismo e do gene estudado. A taxa de mutação é um parâmetro calculado como o numero de mutações observado a cada nova geração - no caso de organismos unicelulares, a cada duplicação celular. Por que essas mutações aparecem? Mutações espontâneas surgem a partir de erros no processo de replicação do DNA ou a partir de lesões espontâneas no material genético. Em bactérias, a enzima DNA polimerase III, responsável pela replicação do DNA, incorpora um nucleotídeo errado com uma freqüência de 10-4/ base/ célula/ geração. A fonte desses erros pode ser o fenômeno de tautomerização (modificação na localização de elétrons) de bases nitrogenadas. Formas raras tautoméricas possuem propriedades de pareamento diferentes da base original e resultam em mutações quando incorporadas no DNA ou quando são usadas como molde durante a replicação (Fig. 4). Pergunta 11: Por que a taxa de mutação (medida pela freqüência de mutações) observada é sempre menor do que a taxa de erros durante o processo de replicação do DNA? 6 Error! Figura 4 – Formas tautoméricas das bases nitrogenadas possuem propriedades de pareamento diferenres das originais. (A) formas comuns – ceto e amino - das bases nitrogenadas e seu pareamento. (B, C) Formas raras - enol e imino – das bases nitrogenadas e seu pareamento alterado. 9 Rearranjos espontâneos tambem são mais frequentes em regiões de seqüências repetitivas curtas de DNA, com alguma homologia. Este processo envolve o sistema de recombinação da célula, com a participação do produto do gene recA e pode causar deleções ou inversões. Em bactérias observa-se duplicação e amplificação (aumento do número de copias) de genes em condições em que a produção aumentada do produto gênico é vantajosa. Pergunta 13: Alguns rearranjos do tipo inversões podem ocorrer em regiões específicas do genoma de bactérias e resultar no desligamento de um gene e desaparecimento do seu produto. Na bactéria Salmonella este tipo de ocorrência controla a expressão de diferentes tipos de flagelo. Você pode imaginar como? Figura 9 – Regiões de seqüência repetitiva no DNA são pontos quentes para mutações do tipo troca de referencial de leitura, uma vez que deslocamentos no pareamento das fitas de DNA podem ser estabilizados e a replicação prossegue. Pergunta 12: Na geração de mutações espontâneas do tipo troca de referencial, a duplicação de seqüências decorre do dobramento de uma das fitas do DNA. Qual delas estaria envolvida neste dobramento no caso de uma inserção, a fita molde ou a recém sintetizada? E no caso de deleção? Figura 8 – Conceito de ponto quente ou hot spot representado pela freqüência de mutações em cada posição do gene lacI de Escherichia coli 10 Mutações induzidas Mutações podem ser geradas por agentes físicos, químicos e biológicos que, quando em contato com células, levam ao aumento na freqüência de mutação em relação às taxas espontâneas. Toda substância capaz de aumentar a taxa de mutações é denominada agente mutagênico. Os agentes mutagênicos químicos e físicos podem ser classificados em três grandes grupos de acordo com o tipo de interação ou lesão que promovem no DNA: (i) os análogos de bases; (ii) os agentes alquilantes; e (iii) os agentes que geram lesões não replicativas e ativam o sistema SOS de reparo. Análogos de bases: os compostos como 2-aminopurina (2-AP) e 5-bromouracil (5- BU) apresentam estrutura semelhante e se comportam como as bases adenina e timina, respectivamente. Estes agentes são incorporados ao DNA durante a replicacao e, em condições normais, possuem as mesmas propriedades de pareamento das bases nitrogenadas. Entretanto, tanto o 2-AP como o 5-BU sofrem ionizações em altas freqüências e alteram suas propriedades de pareamento passando a se comportar como guanina e citosina, respectivamente. Em suas formas ionizadas 2-AP e 5-BU geram transições durante a replicação do DNA. O 2-AP pode gerar transições do tipo AT-GC ou GC-AT dependendo de onde se localiza durante a replicação (na fita molde ou como nucleotídeo a ser incorporado) (Fig. 10). Pergunta 14: Você pode deduzir o processo de geração de mutações induzidas pelo 5-BU? Que tipo de transições podem ocorrer? Agentes alquilantes: Um segundo grupo de agentes mutagênicos são substâncias com propriedades alquilantes, isto é, transferem grupamentos metil e etil a determinadas Figura 10 – Os análogos de base5BrU e 2AP e como seus pareamentos se alteram nas formas normais e ionizadas A 2AP T 2AP C 2AP ionizado T 5BrU 5BrU A 5BrU ionizado G 11 posições de bases nitrogenadas, gerando modificaoes covalentes. Substâncias como o N- metil-N’-nitro-nitrosoguanidina (MNNG) e o metil metano sulfonato (MMS) metilam a guanina e a timina na posição O6 e O4, respectivamente. Essas modificacoes quimicas alteram as propriedades de pareamento das bases, a guanina metilada na posição O6 pareia erroneamente com a timina e gera transições do tipo GC-AT, enquanto a timina alquilada causa transições do tipo TA-CG (Fig. 11). Pergunta 15: A alquilação de outras bases ou em posições diferentes de O6 e O4 da guanina e timina, respectivamente, não levam ao surgimento de mutações. Por quê? Agentes indutores do sistema SOS: Certos agentes mutagênicos sao capazes de gerar lesões que bloqueiam a replicação do DNA. Nesses casos, o complexo de replicação fica impedido de continuar a partir do ponto da lesão, a qual impede a leitura da informação na forma de seqüência de bases na fita molde. Nestas condições é ativado o sistema SOS de reparo, com uma polimerase que atua permitindo a continuação da replicação à custa da incorporação de bases erradas na nova fita de DNA. Estas lesões levam, portanto, à fixação de mutações do tipo troca de bases na fita recém sintetizada (Fig. 12). Os agentes mutagênicos que induzem o sistema SOS englobam uma série de substâncias químicas com propriedades cancerígenas comprovadas, como as aflatoxinas (toxina produzida por um fungo) e benzopirenos (presente no cigarro), os quais intercalam-se na cadeia de DNA entre os pares de base gerando adutos que impedem a replicação. A ativação do sistema SOS pode gerar também mutações do tipo troca de referencial. Outro mutagênico que ativa o sistema SOS é a radiação ultravioleta, que forma lesões do tipo adutos no DNA, entre duas pirimidinas vizinhas na mesma fita (dímeros de pirimidina) (Fig.13). Em bactérias como E. Figura 11 – Pareamento alterado de timina e guanina metiladas e tipos de mutações induzidas 14 Transposons (Tn) são elementos de transposição que contém, além das funções envolvidas na transposição, genes cujos produtos conferem resistência a antibióticos. Diferentes Tn são distinguidos por números. Certos Tn tem uma região central contendo genes de resistência a drogas e elementos IS nas extremidades (ISL e ISR)(Fig. 17). sítio doador sítio alvo 9 pares de base Transposase cliva o sítio doador e o sítio alvo Sítio alvo fica com extremidades de fita simples Transposase liga IS às extremidades do sítio alvo DNA polimerase completa a fita de DNA e ligase junta as extremidades do sítio alvo e do IS Figura 15 – Movimento de um IS saindo de um sítio doador para o sítio alvo. Figura 16 - Quando o IS se transpõe, a seqüência do DNA do hospedeiro no sítio alvo é duplicada (mutação) de modo que o elemento IS fica flanqueado por pequenas seqüências diretamente repetidas. 15 Figura 17 – Tns são elementos se transposição compostos, com diferentes combinações de IS nas extremidades gene de resistência a antibiótico transposição não replicativa Figura 18 – Tipos de transposição transposição replicativa sítio doador clivagem do sítio doador sítio alvo clivagem clivagem do sítio alvo ligação ligação Polimerização do DNA replicação Em alguns casos ISL e ISR são idênticos e estão na mesma orientação, como no Tn9 (seqüências repetidas diretas) ou, no caso de Tn903, em orientações inversas (seqüências repetidas invertidas); em outros casos os ISL e ISR não são idênticos (Fig 17). Elementos IS e a maioria dos transposons se movem por um mecanismo não replicativo, pelo qual o elemento se move diretamente do sítio doador para o alvo. Transposons mais complexos se movem por uma mecanismo que envolve replicação: neste caso, uma cópia permanece no sítio doador e uma nova surge no sítio alvo (Fig 18). 16 Pergunta 16: Você consegue imaginar como um elemento de transposição mais complexo como um Tn pode ter evoluído a partir de elementos do tipo IS? Tipos de mutação gerados por elementos de transposição Além da duplicação do sitio alvo, que ocorre sempre na transposição, o movimento dos elementos de transposição pode causar duplicações extra ou deleções quando, ao sair do sitio doador, a seqüência original não é refeita perfeitamente. Mutações ocorrem também no sítio alvo, pela simples presença do elemento; o elemento pode inativar um gene se for inserido dentro dele ou ao sair de onde estava (Fig. 19). A presença de IS no genoma pode gerar rearranjos. Partes do genoma entre duas cópias de IS próximas podem ser deletadas caso ocorra recombinação entre os IS. Inversões e outros rearranjos também podem ocorrer gerando inclusive novos genes (Fig. 19) e podem alterar funções de seqüências pré-existentes por colocá-las sob um novo sistema de regulação. Transposons podem se transpor facilmente de um cromossoma bacteriano para outra unidade de replicação, como o genoma de um bacteriófago (vírus) ou plasmídeo, e assim podem se espalhar para outras bactérias. O espalhamento de resistência a antibióticos entre populações bacterianas é uma conseqüência da transposição de genes de resistência para plasmídeos (que se replicam dentro das células bacterianas) e do fato de transposons cruzarem barreiras entre espécies. Elementos de transposição constituem cerca de 10% do genoma de eucariotos superiores. Ainda que a maioria destes se mova raramente, eles são tantos que seu movimento tem um grande efeito na variabilidade de uma espécie. Um genoma pode conter elementos de transposição funcionais e não funcionais (incapazes de se mover por não codificar uma transposase funcional). Esses perderam a capacidade de se transpor independentemente, mas podem ser reconhecidos como substratos para transposição pelas enzimas produzidas por elementos funcionais. Elementos de transposição permanecem em silêncio por longos períodos (durante este tempo eles ocupam posições fixas no genoma). Há períodos de grande intensidade de transposição. Esta atividade de transposição e, portanto, esta ação mutagênica é ativada de tempos em tempos em alguns poucos indivíduos na população. Isto causa profundas alterações no genoma, porque envolve transposições simultâneas de vários tipos de elementos de transposição. Em vários organismos estas explosões de transposição são ativadas por condições de estresse, gerando uma variedade de organismos modificados, alguns dos quais podem ser mais adaptados que cepas parentais para sobreviver nas novas condições ambientais. Portanto, elementos de transposição não são necessariamente parasitas ou DNAs egoístas como têm sido chamados, mas podem ocasionalmente agir como simbiontes úteis que favorecem, a longo termo, a sobrevivência das espécies cujos genomas habitam. Deste modo, os elementos de transposição contribuem para a geração da diversidade biológica. 19 agentes mutagêncios, recupera-se bactérias revertentes, isto é, com fenótipo selvagem, capazes de crescer em meio mínimo. Este teste é amplamente usado para avaliar o potencial mutagênico de diversos agentes e seus resultados podem ser correlacionados com o efeito cancerígeno desses compostos em animais. Neste caso, a capacidade de sintetizar histidina é o fenótipo marcador. Outros exemplos de marcadores usados são a resistência a antibióticos ou a resistência à infecção por vírus. Mutantes supressores são um outro tipo de sistema de teste para detectar mutações. Nesses casos uma mutação ao ocorrer suprime o efeito de uma mutação anterior e se recupera o fenótipo selvagem. A mutação supressora pode ocorrer no mesmo gene originalmente mutado ou não. Um desses sistemas consiste no uso de linhagens mutantes da bactéria Escherichia coli incapazes de produzir a enzima beta-galactosidase, o que gera um fenótipo facilmente reconhecível no laboratório. Usa-se uma coleção de linhagens de bactérias com mutações do tipo sem sentido em diferentes locais do gene correspondente. Todas impedem sua expressão, pois geram codons de parada. Quando essas linhagens são expostas a agentes muatagênicos, algumas mutações do tipo substituição de bases restabelecem o fenótipo selvagem de produção da enzima. São mutantes supressores de códigos sem sentido. Alguns tipos de mutações supressoras restauram totalmente a atividade original da enzima, outros parcialmente. Pergunta 19: Por que alguns tipos de mutações supressoras recobram totalmente o fenótipo selvagem e outras não? Pergunta 20: No gene que codifica a beta-galactosidase, para cada tipo de agente mutagênico as mutações supressoras apresentam determinados hot spots, por que? Técnicas para gerar mutações Mutagênese generalizada Agentes químicos ou irradiação são mutagênicos e podem ser usados experimentalmente. A tabela 1 cita alguns agentes muatgênicos, vantagens e desvantagens de uso. Nesses casos as mutações irão incidir sobre todo o genoma do organismo e para cada agente um tipo de mutação será predominantemente gerado. Por exemplo, MNNG gera transições GC para AT e, portanto, substituições de base. É sempre necessária uma etapa posterior que selecione os mutantes desejados e caracterize o tipo de mutação ocorrido. Linhagens de bactéria com alta freqüência de mutação foram desenvolvidas em laboratório. Nestas linhagens a taxa de mutação espontânea é mais alta que a das selvagens, devido a defeitos em mecanismos de reparo. De acordo com o tipo de linhagem, um determinado mecanismo é afetado e o resultado é o aumento de certo tipo de mutação, um exemplo é citado na tabela 1. Nesses casos, o gene que se deseja mutar é transferido para a linhagem “mutadora” e, ao longo de poucas gerações, sofrerá alguma mutação. Só que, mesmo depois que a mutação for conseguida, outras mutações irão se acumular, por 20 isso é necessário retirar o gene da linhagem de teste e transferí-lo para uma bactéria selvagem para estudar sua função. Elementos de transposição podem ser usados em experimentos de biologia molecular para criar inserções dentro de genes e, portanto, inativá-los (nocaute gênico). A vantagem deste tipo de estratégia é a certeza de que o produto deixa de ser gerado e, assim, pode-se estudar o efeito dessa deficiência no metabolismo do organismo e adquirir noções sobre sua função. Junto com o elemento de transposição pode-se inserir genes que conferem resistência a antibiótico, marcadores que facilitam seleção dos mutantes. Pergunta 21: Entre as técnicas citadas acima qual você apontaria como mais apropriada para obter mutantes em genes letais ou essenciais, por que? Mutagênese sítio específica ou dirigida Mutagênese dirigida é um conjunto de técnicas usadas para gerar mutantes por meio da alteração precisa de determinados pares de base em uma seqüência de DNA. Um objetivo comum deste tipo de estratégia é alterar as propriedades bioquímicas de uma proteína com o intuito de usá-la em processos biotecnológicos, ou então gerar um conjunto de mutantes, cada um com um ou poucos aminoácidos alterados, e realizar um mapeamento detalhado da importância que cada região da proteína tem para sua função. Portanto, neste tipo de estudo se manipula a informação genética em laboratório de uma forma planejada. De início seleciona-se a seqüência do gene a ser estudada, em seguida escolhe-se as alterações a serem feitas e finalmente avalia-se o resultado em termos da função da proteína mutante em comparação com a selvagem. Logo, o ponto de partida é conhecer a seqüência de nucleotídeos na região do DNA, ou do gene, que codifica a proteína de interesse. Com o avanço dos projetos genoma, que vêm disponibilizando na rede mundial de computadores dados de seqüenciamento do genoma de diversos organismos, cada vez um numero maior de genes é conhecido. Embora para a maioria deles não se consiga atribuir a função da proteína correspondente, no caso de proteínas cuja função ou seqüência são evolutivamente conservadas, passa-se assim a dispor da seqüência do gene. Dispondo da seqüência e da molécula de DNA em si, como decidir qual o códon a ser alterado? Se a estrutura tri-dimensional da proteína já é caracterizada, torna-se mais fácil determinar que aminoácido(s) deve(m) ser trocado(s) para que a proteína adquira uma propriedade específica. Para a maioria das proteínas esta informação não é conhecida. Nestes casos, a estratégia para a introdução de uma alteração específica na proteína é a de tentativa e erro. Assim é gerado um painel de proteínas mutantes entre as quais pode se encontrar aquela com a atividade procurada. Naturalmente, cada uma destas proteínas tem que ser testada pra se verificar se a mutação realmente produziu a alteração desejada. 21 Pergunta 22: Além da alteração de aminoácidos em uma proteína, que tipo de conclusões poderiam ser tiradas no caso de se utilizar a mutagênese dirigida em regiões que controlam a expressão de um gene? Técnicas de mutação dirigida Várias estratégias já foram desenvolvidas para introduzir mutações dirigidas em genes clonados. Alguns dos métodos visam trocar nucleotídeos específicos no gene, outros introduzem alterações ao acaso ao longo de um pequeno fragmento do gene, gerando, assim, um grupo de proteínas mutantes. Técnicas de biologia molecular são utilizadas para cada passo dos procedimentos experimentais. Inicialmente obtém-se, a partir de um genoma, várias cópias do fragmento de DNA cuja seqüência será mutada e para tal usa-se a técnica de reação em cadeia da polimerase, PCR. Em seguida essa seqüência é inserida (clonada) em pequenas unidades replicativas de DNA (vetores, plasmídeos) que podem ser mantidas e multiplicadas em bactérias no laboratório e então purificadas. As várias técnicas de mutagênese tiram partido das propriedades de pareamento entre duas fitas de DNA com seqüências complementares (Fig. 20). Em algum passo do procedimento de mutagênese obtém-se o DNA a ser mutado no estado de fita simples que é então misturado a um fragmento de DNA pequeno, de poucas bases (oligonucleotídeo sintético) que tem seqüência complementar a uma região do gene clonado, exceto por um ou poucos nucleotídeos. Este nucleotídeo não complementar coincide precisamente com o nucleotídeo que é o alvo da troca (Fig. 20). O oligonucleotídeo se combina com a região complementar do gene e sua extremidade 3’ vai agir como um iniciador da síntese do DNA, que usa a fita do DNA original como molde. A replicação se dá em presença dos quatro desoxiribonucleotídeos (dNTPs) e da enzima DNA polimerase. O DNA fita dupla resultante contendo o(s) nucleotídeo(s) não complementar(es) é de novo introduzido em células de bactéria. O DNA na forma de plasmídeo se replica e as células produzem moléculas que carregam o gene selvagem e outras que contém o gene mutado. É possível selecionar aquelas que têm a versão mutante do gene. Este então é isolado e transferido para outro vetor (plasmídeo), cujas características permitem que a proteína que ele codifica seja expressa em um organismo diferente do original (transgênico). A proteína alterada é expressa em grandes quantidades e purificada para futuros estudos. 24 Engenharia de proteínas Mutações específicas podem alterar a estabilidade de uma proteína em temperaturas extremas ou diferentes pH, podem alterar a especificidade ou a afinidade de uma enzima por seu substrato, podem alterar as propriedades de regulação alostérica, ou requerimentos de co-fatores por exemplo, facilitando seu uso em processos industriais. Apenas dezenas entre as milhares de enzimas que já foram estudadas e caracterizadas bioquimicamente são usadas industrialmente. Na Tabela 2 estão listadas as mais importantes e seus usos industriais. A principal razão para que um número maior de enzimas ainda não seja utilizado é que essas moleculas foram naturalmente selecionadas para desempenhar suas funcoes nas condições naturais, no interior da célula ou organismo em que sao produzidas, e essas condicoes em geral nao coincidem com aquelas usadas nos processos industriais. Entretanto, com a disponibilidade de técnicas de mutagênese e producao em larga escala de proteínas a partir de organismos geneticamente modificados, algumas dificuldades têm sido superadas. A seguir sao citados alguns exemplos. Tabela 2 – enzimas e seus usos industriais enzima uso industrial alfa-amilase produção de álcool, cervejaria catalase antioxidante para alimentos protease detergentes glicose oxidase antioxidante para alimentos lipase fabricação de queijo, aromatizante papaína amaciante de carne Alteração da estabilidade da proteína Adição de pontes de sulfeto (S-S) A estabilidade térmica de uma proteína pode ser aumentada por adição de pontes S-S na molécula, gerando uma molécula que não se desnatura facilmente em altas temperaturas. Enzimas termo-estáveis são em geral resistentes também à desnaturação por solventes orgânicos e a condições não fisiológicas tais como pHs extremos. Ex: A enzima lisozima do bacteriófago (vírus que infecta bactérias) T4. Seis variantes foram construídas por mutagênese dirigida (Tab.3). Foram inseridas cisteínas que permitem a formação de pontes S-S intramoleculares (Fig.21). Dois, quatro ou seis resíduos de aminoácidos foram trocados por cisteína gerando variantes com uma, duas ou três pontes S- S, respectivamente. Os resíduos de aminoácidos que foram trocados por cisteína eram espacialmente próximos uns dos outros na enzima ativa, isto é, na sua estrutura tri- dimensional (Fig. 21). Esta proximidade assegurou que a conformação da molécula como um todo não fosse afetada pela formação das novas pontes de sulfeto. Os aminoácidos trocados não faziam parte do sítio ativo da enzima, que é a porção da molécula mais sensível a 25 pequenas alterações de conformação. Após a mutagênese, as versões mutantes foram expressas em bactéria; as proteínas foram purificadas e suas atividades enzimáticas e estabilidades (definidas como a temperatura em que 50% da estrutura da molécula como um todo foi desnaturada) foram determinadas. • Analise os dados da tabela 3 e verifique qual(is) o(s) efeito(s) da presença das pontes S- S na estabilidade da proteína. Tabela 3 – Propriedades das versões selvagem e mutantes da lisozima do fago T4 wt – selvagem; pwt – pseudoselvagem, A a F – variantes construídas, Tm – temperatura em que a enzima retém 50% de sua atividade. posição do aminoácido no. de atividade enzima pontes relativa Tm Troca de aminoácidos Quando proteínas são submetidas a altas temperaturas, resíduos de asparagina e glutamina sofrem desaminação, uma reação de liberação de amônia, originando ácido aspártico e ácido glutâmico, respectivamente. Estas alterações podem mudar a conformação da proteína e acarretar perda da sua atividade. A enzima triosefosfato isomerase de Saccharomyces cerevisae (levedura) consiste de duas subunidades idênticas, cada uma com dois resíduos de asparagina. Estes resíduos Figura 21 - Estratégia de engenharia da enzima lisozima do fago T4 visando aumentar a estabilidade. Na estrutura terciária da proteína, três pontes de S são mostradas. Os números indicam as posições das cisteínas. A cisteína 54 foi trocada por treonina para que não interfrisse com a formação das outras pontes. 26 podem estar envolvidos na sensibilidade da enzima à temperatura por se encontrarem na superfície de contato entre as subunidades na enzima ativa. Por meio de mutagênese dirigida, os resíduos de asparagina nas posições 14 e 78 foram trocados e a estabilidade das proteínas mutantes foi determinada (Tab. 4). • Interprete os dados da Tabela 4 As proteínas mutantes também foram testadas quanto à sensibilidade à digestão proteolítica e verificou-se uma correlação positiva entre a estabilidade e a resistência à digestão. Estes resultados mostram que é possível obter formas termo-estáveis de uma enzima por mutação de códons de asparaginas não essenciais. Tabela 4 – Estabilidade das versões selvagem e mutantes da enzima triosefosfato isomerase a 100oC. A estabilidade é expressa como meia-vida ou taxa de inativação a 100oC. Uma maia-vida mais longa indica que a enzima é mais estável. posição do aminoácido enzima 14 78 meia-vida (min) Alteração da atividade enzimática A mutagênese dirigida pode ser utilizada para modificar a atividade catalítica de uma enzima. Redução de pontes S-S Quando uma proteína é expressa em um organismo diferente do original, pode ser menos ativa que o esperado. Mas sua atividade pode ser alterada por mutagênese dirigida. O gene do interferon β (IFNβ) humano foi clonado e expresso na bactéria Escherichia coli e sua atividade antiviral foi detrminada. A proteína produzida reteve apenas 10% da atividade da forma original produzida em células humanas. Observou-se que a maior parte do IFNβ sintetizado em E. coli se encontrava agregado, na forma de dímeros e oligômeros, que são inativos. A análise da sequência do DNA do gene do IFNβ revelou que a proteína correspondente tem três resíduos de cisteína, que poderiam estar envolvidos na formação de pontes S-S intermoleculares, favorecendo a formação de dímeros e oligômeros. Os resíduos de cisteína foram trocados por serina. (Por que serina e não outro aminoácido?) A troca de um dos resíduos de cisteína (Cis-17) pela serina produziu uma proteina que não formava agregados e com atividade semelhante a da autêntica IFNβ, além de ser mais estável quando estocada por longos períodos. 29 BIOFÍSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGÊNESE Estudo dirigido II – Origem das mutações – mutações espontâneas 1- Diferencie “lesão”de “mutação”. 2- A taxa de erro estimada no processo de replicação do DNA de uma bactéria pela DNA polimerase III é de cerca de 10-4/base/célula/geração, entretanto a taxa de mutação medida varia entre 10-10 e 10-12 . Que processos devem levar a esta diminuição da taxa de erros? 3- A desaminação da Citosina (C) transforma-a em Uracil.(U). Em uma célula animal cerca de 100 eventos destes ocorrem espontaneamente a cada 24 horas: a- baseando-se nas informações acima sugira porque o DNA possuI Timinas (T) e não Uracilas (U). b- se não houvesse sistema de reparo para remover os U do DNA, qual seriam, a longo prazo, as conseqüências da presença do U no DNA, para o código genético? 4- Na geração de mutações espontâneas tipo troca de referencial, a duplicação de seqüências decorre do dobramento de uma das fitas do DNA durante o processo de replicação. Qual delas estaria dobrada no caso de inserção e de deleção? BIOFÍSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGÊNESE Estudo dirigido III – Origem das mutações – mutações induzidas 1. Como se dá o processo de geração de mutações induzidas pelo 5 Br Uridina? Que tipo de transições podem ocorrer? 2. A alquilação da guanina na posição O6 e da timina na posição O4 levam a que transições? Porque a alquilação em outros átomos nestas bases não levam a mutações? 3. Um grande número de agentes mutagênicos são capazes de gerar lesões que bloqueiam a replicação do DNA. Nestas condições o sistema SOS é ativado levando freqüentemente à fixação de mutações. Explique como isto ocorre. 4. Bacillus subtilis é uma bactéria de solo que forma esporos quando há falta de nutrientes no meio onde se encontra. Esporos são estruturas metabolicamente dormentes que podem sobreviver por mais de mil anos. Eles também apresentam um conteúdo de água muito reduzido. Sugira como é que os esporos evitam o acúmulo de mutações potencialmente letais no seu DNA durante seus longos períodos de dormência. BIOFÍSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGÊNESE Estudo dirigido IV – Mutações mediadas por elementos de transposição 1- Por que a atividade de elementos de transposição pode ser mutagênica? 2- Cite alterações no genoma que sejam conseqüências de transposição destes elementos. 3- Por que elementos de trasnposição são as vezes chamados de “ DNA egoísta”? 4- Quais os componentes mínimos necessários para a existência de um elemento de transposição? 5- Quais as diferenças entre uma seqüência de inserção e transposon? BIOFÍSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGÊNESE Estudo dirigido V – Aplicações experimentais da mutagênese 1. Cite algum motivo de interesse para se gerar um organismo mutante em laboratório. 2. O que é um gene marcador? 3. O que é um organismo transgênico? Imagine um organismo desse tipo que você queira construir e sua utilidade. 4. Cite uma forma de gerar mutações generalizadas em todo o genoma, a vantagem e a desvantagem do método. 5. O que é e que utilidade pode ter a mutagênese dirigida? 30 BIOFÍSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGÊNESE Estudo dirigido VI – Engenharia de proteínas 1- A engenharia de proteínas visa obter variantes de proteínas que apresentem determinadas propriedades importantes para uso terapêutico ou industrial. Cite algumas dessas propriedades. 2- Que cuidados você teria ao alterar um aminoácido em uma proteína? 3- Por que é mais fácil realizar engenharia de proteína e melhoria em proteínas cujas estruturas tridimensionais são conhecidas? 4- Como um “engenheiro de proteínas” que tipo de produto você gostaria de desenvolver e com que finalidade?