Bioquimica

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(Parte 5 de 8)

2 2 0.084 3 4 0.168 4 6 0.252

5 8 0.336 6 10 0.420

Concentração da uréia: 5 mM; Concentração da urease: 0,1 µg/mL; Volume de reação: 1 mL; Temperatura: 30oC.

Os dados da Tabela 3 mostram que a velocidade da reação é constante ao longo do tempo estudado. Já os dados da Tabela 4 mostram variações relativamente complexas da velocidade de reação em função da concentração da uréia para um período de 10 minutos de reação.

Os dados da Tabela 4 permitem medir experimentalmente duas constantes importantes das reações enzimáticas Vmax (velocidade máxima) e Km (constante de Michaelis) através da equação v = Vmax[S] / (Km + [S]).

Tabela 4. Cinética da enzima urease.

Tubo n° Uréia (mM) Urease (µg) NH3 (µmoles) 1 2,5 0,1 0,21

2 5,0 0,1 0,42 3 10 0,1 0,59 4 15 0,1 0,67 5 25 0,1 0,73 6 50 0,1 0,78 7 100 0,1 0,79 8 200 0,1 0,78 9 20 - 0,0

Os significados de Vmax e Km são definidos no modelo de cinética enzimática proposto por Michaelis e Menten no início do século passado onde ES é um complexo enzima – substrato formado antes de conversão do substrato em produtos.

v = Vmax[S] / (Km + [S]) = kcat[Et][S] / (Km + [S])

A derivação da equação Michaelis – Menten: é apresentada na próxima página.

E + SES E + Pkcat

Fração de Etotna forma de ES = [S]/(Kdiss+ [S])

Velocidade naquela [S]

Velocidade máxima Concentração do substrato

Kdissaparente do Complexo enzima-substrato

5. Substâncias que reduzem a atividade de uma enzima são chamadas inibidores. Em termos gerais, inibidores podem atuar em várias maneiras. Aqui vamos focalizar em inibidores que ligam reversivelmente com a enzima com constantes de dissociação KI. Estes tipos de inibidores podem atuar em duas maneiras diferentes: a) Eles podem competir com o substrato para o mesmo sítio de ligação na superfície da enzima livre. Neste caso são chamados inibidores competitivos ou b) Eles podem ligar em outro sítio na enzima livre (E) e/ou no complexo enzima-substrato (ES). Estes inibidores são chamados inibidores mistos/nãocompetitivos se podem ligar a E e ES e são chamados acompetitivos se ligam somente ao complexo ES.

Km obs = Km(1+[I]/KI) = αKmonde α = (1+[I]/KI)

6. A presença de um inibidor competitivo se manifesta em uma mudança no valor do Km: 7. A presença de um inibidor misto/não-competitivo se manifesta em uma mudança nos valores do

Km obs = Km(1+[I]/KI)/(1+[I]/KI’) = αKm / α’
Vmax obs = Vmax / α’

Km e no valor do Vmax:

8. A presença de um inibidor acompetitivo se manifesta em uma mudança nos valores do Km e no valor do Vmax:

Km obs = Km / (1+[I]/KI’) = Km / α’
Vmax obs = Vmax / α’

Grupo de discussão 6

1) As velocidades de uma reação enzimática foram determinadas para diversas concentrações de substrato, conforme a tabela abaixo:

[S] (µM) V (µmol/L.min)

Os gráficos de, respectivamente, V em função de [S] e 1/V em função de 1/[S] podem servir para determinar Km e Vmax? Como?

2) Numa reação enzimática, o valor de Vmax, mas não o de Km é diretamente proporcional à concentração da enzima? Justifique.

3) A velocidade inicial de uma reação enzimática em função da concentração do substrato S, na ausência e na presença dos inibidores A e B segue os dados da tabela abaixo:

VELOCIDADE (µMOL/L X MIN) [S] (µM) SEM I Com Inibidor A Com Inibidor B

1,25 1,72 0,98 1,01 1,67 2,04 1,17 1,26 2,5 2,63 1,47 1,72 5,0 3,3 1,96 2,56 10,0 4,17 2,38 3,49 a) Qual é a classe dos inibidores A e B? b) Determine Vmax e Km na ausência e presença dos inibidores.

4) Utilizando-se dos valores de Km e Vmax determinados nas questões 1 e 3, esquematize num mesmo gráfico, para as duas reações, V em função da concentração de substrato, expressa em múltiplos de Km. No eixo dos Y ajuste arbitrariamente as escalas para cada reação fazendo coincidir os pontos de V = Vmax. Como são as curvas para duas reações? Justifique o resultado.

5) O que são enzimas alostéricas? Defina utilizando-se de gráficos esquemáticos de V em função de

[S], compare uma enzima michaeliana (da questão 4) com uma enzima alostérica positiva e com uma enzima alostérica negativa.

MÓDULO 7: MECANISMOS DE CATÁLISE ENZIMÁTICA

1. Catálise acido/base – catálise por transferência de protons. A catálise ácida é um processo no qual a transferência parcial de prótons de um ácido para o estado de transição diminui a energia livre do estado de transição de uma reação. A reação pode ser também estimulada por uma catálise básica se a taxa de reação aumentar com a abstração de um próton por uma base. Algumas reações podem ser sujeitas simultaneamente a ambos os processos, caracterizando uma catálise ácido-base. Em reações catalisadas por enzimas os ácidos e bases catalisadores são grupos específicos ionizáveis da enzima localizados no seu sítio ativo/sítio catalítico. A mutarrotação da glicose (Figura 6) e a catálise da ribonuclease pancreática bovina A (RNase A) (Figura 7) são exemplos de catálise ácido-base.

Figura 6. Mutarrotação da glicose.

2. Catálise covalente envolve a aceleração da taxa de reação através da formação transiente de uma ligação covalente substrato-catalisador. A descarboxilação do acetoacetato é um exemplo deste processo:

No primeiro estágio desta reação, a amina faz um ataque nucleofílico ao grupo carbonila do acetoacetato formando uma base de Schiff (ligação imina).

O átomo de nitrogênio protonado do intermediário covalente atua como um receptor de elétrons reduzindo assim o caráter de alta energia do enolato. A catalise covalente possui estágios nucleofílicos e eletrofílicos. A catálise covalente pode ser dividida conceitualmente em três estágios:

1) A reação nucleofílica entre o catalisador e o substrato formando uma ligação covalente. 2) A perda de elétrons do centro da reação pelo catalisador agora eletrofílico. 3) A eliminação do catalisador que é uma reação essencial para retornar ao estágio 1.

Grupo de discussão 7

1) Examine a reação de hidrólise de RNA catalisada pela RNase A para verificar que se trata de um mecanismo de catálise ácido-base.

2) Faça o gráfico da velocidade de uma reação enzimática em função do pH para uma enzima estável entre pHs 3 e 12, considerando que o substrato não possui grupos ionizáveis e a atividade enzimática exige no centro ativo uma carboxila (pKa = 5) desprotonada e um grupo amino (pKa = 9) protonado.

3) Definir catálise eletrostática. Procure um exemplo de uma enzima que utiliza esta estratégia.

4) Descrever o mecanismo empregado pelas serina proteases (tripsina, quimiotripsina, elastase, etc) para hidrolisar ligações peptídicas. Descrever todas as etapas da reação. Quais tipos de catálise são empregados em cada uma das etapas?

MÓDULO 8: AÇÚCARES: ESTRUTURA E FUNÇÃO

1. Os carboidratos são compostos que apresentam a fórmula empírica (CH2O)n (n> ou = 3), sendo funcionalmente poliidroxialdeídos ou poliidroxicetonas. Os carboidratos mais simples são os monossacarídeos, que se apresentam na formas de aldoses ou cetoses, conforme o grupo funcional carbonílico que possuem, isto é, respectivamente, aldeído ou cetona. Há duas trioses: o gliceraldeído, uma aldotriose, e a diidroxiacetona, uma cetotriose (Figura 8). O gliceraldeído apresenta um carbono (C2) assimétrico, dando origem a dois isômeros opticos, as formas D e L (Figura 9). Já a diidroxiacetona não possui C assimétrico e, por isso, não mostra esse tipo de isomeria. Os outros monossacarídeos podem ser derivados pelo crescimento da cadeia destas duas trioses. A Figura 10 mostra a família D derivada do D- gliceraldeido, cujas fórmulas estruturais planares obedecem as regras de Fisher.

Figura 8. Gliceraldeído e diidroxiacetonaFigura 9: Carbono quiral ou

carbono assimétrico.

Figura 10. Família D derivada do D-gliceraldeído. Figura 1. Ciclização da D-glicose.

O aumento da cadeia do monossacarídeo leva ao aparecimento de novos Cs assimétricos e, portanto mais isômeros estruturais, também chamados estereoisômeros. O número de isômeros é dado pela expressão 2n onde n é o número de carbonos assimétricos. Por exemplo, em aldoexoses há 4 Cs assimétricos, logo o número de isômeros é 24 =16, sendo 8 da forma D e 8 da forma L. Mas, as estruturas lineares como representadas na Figura 10 tanto para pentoses como para hexoses são poucos estáveis em solução, formando estruturas cíclicas segundo a reação mostrada na Figura 1. Esta é uma reação bem conhecida da química orgânica, pela qual um álcool (OH) faz uma adição nucleofílica a carbonila de um aldeído, formando um composto de condensação da conhecido como semiacetal. No caso do exemplo da Figura 1 a hexose é a D-glicose e, como a figura mostra, a ciclização leva ao aparecimento de uma outra isomeria estrutural devido às duas posições possíveis do OH do C1 em relação ao plano do anel, gerando os isômeros α e β. É importante enfatizar que o OH do C1 não é quimicamente equivalente aos demais OHs que são alcoólicos, sendo por isso chamado de OH glicosídico. A existência do OH glicosídico permite que todos os monossarídeos sejam oxidados em condições brandas pelo reagente de Fehling, uma reação de oxido-reação na qual os OHs alcoólicos não participam.

Figura 12. Nomenclatura para estereoisômeros.

2. Conforme exemplificado na Figura 12 há uma nomenclatura especificamente designada para distinguir pares de estereoisômeros. Enantiômeros possuem estruturas isoméricas que são uma imagem especular da outra, por exemplo, cada membro da família D de hexoses mostrada na Figura 10 tem um, e, somente um, enantiômero na família L. São epímeros pares de estereoisômeros que diferem apenas pela configuração de um C assimétrico. São anômeros os dois isômeros resultantes da posição do OH glicosídico do C1 na estrutura cíclica da hexose. E, finalmente, são denominados diastereoisômeros pares de isômeros que não caem em nenhuma das categorias anteriores.

3. Ligação glicosídica: os monossacarídeos podem se apresentar na forma de oligo ou polissacarídeos, onde os monômeros são ligados através de ligações glicosídicas. Oligossacarídeos são formados por um pequeno número de monossacarídeos, resultantes da condensação de um OH glicosídico com um OH alcoólico, como exemplificado abaixo pela dimerização de duas moléculas de α-glicose por ligação 1-4, originando o dissacarídeo maltose:

Caso a ligação glicosídica envolva a condensação dos dois OHs glicosídicos como é o caso da trealose, uma α1-1-diglicose, o dissacarídeo não pode ser oxidado pelo reagente de Fehling (dissacarídeo não redutor). Já a maltose, que possue um OH glicosídico livre é um dissacarídeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling.

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