Roteiro experimento microbiologia

Roteiro experimento microbiologia

A microbiologia é o ramo da biologia que estuda os microorganismos que são definidos, em princípio, como seres microscópicos. Apesar de ser uma visão bastante simplificada, de modo geral, é correta. Estes seres englobam uma grande diversidade biológica cujos principais grupos são os vírus, as bactérias, as arqueas, as algas, os protozoários e os fungos.

Os microorganismos são encontrados em praticamente todos os ambientes naturais como solo, ar, água, esgoto, plantas, corpo humano e outros animais. Desta forma, para estudar os microorganismos de um determinado material/ambiente, todo o procedimento deve ser realizado em um ambiente livre de microorganismos (ou ambiente estéril). Isto significa que todo o microorganismo encontrado no experimento será oriundo do material/ambiente estudado.

Existem algumas manobras durante a manipulação do material que impedem a entrada de microorganismos, as manobras assépticas. Tais manobras envolvem basicamente um bico de Bunsen (Figura 1) e a realização de toda a manipulação deverá ser feita dentro da chamada “zona de segurança”. A zona de segurança é a região em torno da chama mais próxima possível sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. A utilização do Bico de Bunsen é essencial pois visa a diminuição de microorganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: zona neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para a flambagem), zona redutora e zona oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a flambagem).

Figura 1Figura 1Figura 1Figura 1. Foto da combustão de GLP em ar em um bico de Bunsen e zonas da chama.

4 BASE EXPERIMENTAL DAS CIÊNCIAS NATURAIS

O material utilizado na manipulação (meios de cultura, vidraria, entre outros) também deve ser livre de microorganismos. Para torná-los estéreis ou para controlar o crescimento bacteriano neste material, diversos métodos de assepsia e desinfecção, químicos ou físicos, são utilizados. A tabela 1 mostra os principais métodos químicos e físicos de assepsia e desinfecção.

Tabela 1 – Métodos químicos e físicos de assepsia e desinfecção.

Métodos químicos

Agente Uso Modo de ação Tempo de exposição

Álcoois (70-80%) Antissépticos

Desinfectantes

Desnaturação protéica dissolução de lipídeos Curto (10-15 min)

Fenóis Desinfectantes Desnaturação protéica Efeito imediato

Compostos Quaternários de amônio

Antissépticos Sanitizantes Desinfectantes (instrumentos cirúrgicos)

Alteração da membrana celular bacteriana Curto (10-30 min)

Cloro Tratamento da água

Inativação enzimática agente oxidante Efeito imediato

Iodo Antissépticos

Desinfectantes Inativação enzimática Efeito imediato

Iodóforos Antissépticos

Desinfectantes Inativação enzimática Efeito imediato

Aldeídos*** Desinfectantes (instrumentos e superfícies)

Desnaturação protéica agente alquilante

Curto (formas vegetativas) Prolongado (esporos)

Metais pesados Antissépticos Inativação enzimática Só agem enquanto em contato

Métodos físicos

Calor úmido (autoclave)

Vidraria, meios de cultura, artigos hospitalares etc

Desnaturação de proteínas 20 minutos

Calor seco (estufa a 1700C)

Instrumentos metálicos, óleos e vidrarias

Desnaturação de proteínas e oxidação Duas horas

Filtração Líquidos, meios de cultura

Retenção de partículas maiores que o poro do filtro (0,25 µm)

Imediato

Radiação

(ionizante, ultravioleta)

Vidrarias, plásticos, superfícies, preservação de alimentos

Formação de dímeros de pirimidina no DNA e de radicais livres

15 minutos (UV)

Neste experimento, o material utilizado será esterilizado por autoclavação.

Outros procedimentos podem ser realizados para evitar ou restringir o crescimento de microorganismos em meios de cultura. Um exemplo é a adição de antibióticos aos meios de cultura. Antibióticos são compostos que têm efeito citotóxico ou citostático sobre células bacterianas. Os antibióticos mais utilizados são os que inibem a síntese da parede celular bacteriana (ex: beta-lactâmicos) , os que inibem a síntese protéica das bactérias (ex: aminoglicosídicos), os que inibem a replicação bacteriana (ex: quinolonas) e os que causam citotoxicidade por produção de intermediários reativos (ex: nitrofuranos).

Em hospitais, é bastante comum o isolamento e identificação de microorganismos de um paciente com doença de etiologia bacteriana. Durante este processo, faz-se testes de susceptibilidade das cepas de bactérias a diversos antibióticos (antibiograma) para maior eficácia do tratamento, principalmente em casos de infecção por cepas resistentes.

OBJETIVOSOBJETIVOSOBJETIVOSOBJETIVOS

Verificar a presença de microorganismos em diversos objetos/ambientes em meios de cultura com ou sem antibiótico. Para tal, todo o procedimento deverá ser realizado utilizando manobras assépticas em um ambiente estéril.

PARTE EXPERIMENTALPARTE EXPERIMENTALPARTE EXPERIMENTALPARTE EXPERIMENTAL
Material e ReagentesMaterial e ReagentesMaterial e ReagentesMaterial e Reagentes

− Balança semi-analítica − Espátulas de pesagem

− Béqueres ou erlenmeyers de 250 mL

− Proveta de 100 mL

− 1 garrafa de vidro com tampa autoclavável (ex. garrafa de água tônica)

− Reagentes para preparação do meio de cultura (ver tabela 2)

− Autoclave

− Tubos Falcon ou provetas de 50 mL estéreis

− 2 Placas de Petri

− caneta de retroprojetor

− swabs ou cotonetes estéreis

− fita crepe

− fita de autoclave

− água estéril

Tabela 2Tabela 2Tabela 2Tabela 2Meio LB-ágar suplementado com glicose na presença ou ausência de ampicilina

− ampicilina (antibiótico)

Reagentes Para 1000 mL de meio com antibiótico Para _ mL de meio

LB Broth 25 g Ampicilina 100 µg/mL Glicose 20 g Água Para completar 1L Agar bacteriológico 15 g

ProcedimentoProcedimentoProcedimentoProcedimentossss

46464646 BASE EXPERIMENTAL DAS CIÊNCIAS NATURAIS

PARTE A PARTE A PARTE A PARTE A −−−− Preparação do meio de cultura dos microorganismos

Sempre que for fazer um experimento, faça APENAS a quantidade de meio de cultura que for usar. Nesta prática, utilizaremos duas placas de Petri contendo meio de cultura.

− Calcule o quanto de cada reagente você precisa para preparar 20 mL de meio por placa de Petri.

− Pese cada reagente separadamente e junte-os em um béquer, EXCETO o ágar.

− Transfira o ágar para a garrafa de vidro.

− Acrescente ao béquer um volume de água menor do que o volume final do seu meio (i.e., se você for preparar 1000 mL de meio, acrescente 800 mL de água).

− Agite a solução contendo água + reagente até dissolver totalmente.

− Passe a solução para a proveta de 100 mL

− Complete com água até o volume desejado

− Transfira o meio líquido para a garrafa com ágar.

− Escreva o nome da solução, a data e o nome de quem fez o meio em um pedaço de fita crepe e cole na garrafa.

− Autoclave por 15 minutos.

PARTE B PARTE B PARTE B PARTE B −−−− Preparação das placas de Petri

Enquanto espera a autoclavagem, anote na parte de baixo da placa se o meio terá antibiótico ou não, o seu nome (ou nome do grupo) e a data. Divida a parte de baixo da placa em quatro partes iguais com uma caneta de retroprojetor (Figura 2).

Figura 2.Figura 2.Figura 2.Figura 2. Esquema de divisão das placas com e sem antibiótico.

− Depois que o meio de cultura foi autoclavado, espere o meio esfriar até conseguir encostar a garrafa no antebraço.

− Acenda o bico de Bunsen.

− A partir deste ponto, TODA a manipulação deverá ser feita na zona de segurança do bico de Bunsen.

− Verta 20 mL de meio em uma das placas e deixe a placa semi-aberta.

− Verta outros 20 mL em um tubo falcon ou proveta estéril e adicione o antibiótico ampicilina. Verta o meio com antibiótico na placa de Petri e deixe a placa semiaberta.

− Espere o meio solidificar.

− Faça os testes da seguinte forma: (sempre perto da chama)

− Quadrante Controle: não passe nada;

− Quadrante Etanol 70%, lave as mãos com etanol 70% e depois esfregue o dedo no meio de cultura;

− Quadrantes Teste1 e Teste 2, esfregue um swab ou cotonete em alguma superfície onde você queira testar se há microorganismos. Pode ser em cima da bancada, na pele, em notas de 1 real, cabelo etc. Ou, teste diferentes formas de lavar as mãos: com sabão de côco, detergente, sabonetes etc.

− Utilize o mesmo “tratamento” dos Teste 1 e 2 nas duas placas (com e sem antibiótico).

− Quando terminar, feche a placa de Petri e coloque de cabeça para baixo e coloque na estufa para crescimento durante toda a noite.

QUESTÕES DE VERIFICAQUESTÕES DE VERIFICAQUESTÕES DE VERIFICAQUESTÕES DE VERIFICAÇÃOÇÃOÇÃOÇÃO

1. Explique o que aconteceu com o seu experimento.

2. Houve crescimento de algum microorganismo no seu experimento controle? E no etanol 70%? Justifique?

3. Quais foram os testes que você fez e explique o resultado. Qual seria o controle negativo e qual seria o controle positivo? Justifique?

4. Que tipos de microorganismos que cresceram nas placas? Você poderia inferir este resultado visualmente?

5. Em vista do experimento realizado, quais as medidas de assepsia devem ser tomadas ao se manipular amostras biológicas? O que significa “ambiente estéril”?

6. Mostre as diferenças entre um material limpo e um material estéril.

7. Explique resumidamente o funcionamento de uma capela de fluxo laminar e qual foi a alternativa que utilizamos em seu lugar? Por que? Em que situações esta alternativa é válida?

REFERÊNCIASREFERÊNCIASREFERÊNCIASREFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIBLIOGRÁFICAS BIBLIOGRÁFICAS BIBLIOGRÁFICAS

Vermelho, A.B.; Pereira, A.F.; Coelho, R.R.R; Souto-Padrón, T. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan (2006)

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/antibiotics.html#relatedissues acessado em 10/10/2006.

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