cromatografia, Notas de estudo de Química

Baixe cromatografia e outras Notas de estudo em PDF para Química, somente na Docsity! 1 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EM FASE LÍQUIDA 1. Definição 2. Histórico 3. Classificação 3.a. Planar vs coluna 3.b. Modos de desenvolvimento 3.c. Mecanismos de separação 4. Coeficiente de partição 5. Fator de retenção, k 6. Fator de separação, α 7. Teoria cinética versus Teoria dos pratos 8. Seqüência de eventos (pratos) 9. Eficiência da coluna, N e H 9.a. Gaussiana 10. Alargamento das bandas 10.a. Equação de van Deemter 10.b. Efeitos extra coluna 11. Resolução; Rs em função das condições DEFINIÇÃO A cromatografia é um método físico-químico que permite a separação de componentes de uma mistura, através da distribuição destes componentes em duas fases, que estão em contato íntimo. Em todas as separações cromatográficas, a amostra é dissolvida numa fase móvel (líquido, gás ou fluido supercrítico). A fase móvel é então forçada através de uma fase imiscível, fase estacionária, a qual é fixa na coluna ou em uma superfície sólida. Os componentes que são fortemente retidos pela fase estacionária movem devagar com o fluxo da fase móvel. Em contraste, os componentes que interagem fracamente com a fase estacionária movem mais rapidamente. Como conseqüência dessas migrações diferenciadas, os vários componentes da mistura se separam em bandas discretas e podem ser analisados qualitativamente ou quantitativamente. HISTÓRICO - primórdios Processos envolvendo migração diferencial já eram conhecidos. Paralelo ao trabalho de Tswett, REED, na Inglaterra, e DAY, nos Estados Unidos, aplicaram colunas contendo sólidos para a separação de sais orgânicos e amostras de petróleo, respectivamente. Antes disso, RUNGE descreveu os “desenhos” feitos por misturas de sais e por tintas que foram colocadas no centro de um papel de filtro e depois espalhadas pela passagem de um solvente, enquanto SCHOENBEIN fez experiências similares com tiras de papel mergulhadas em solventes. O uso de sólidos de camada delgada sobre vidro, no lugar de papel, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos foi experimentado por BEYERINCK, em 1889. 2 HISTÓRICO – início do século XX Os termos cromatografia, cromatograma e método cromatográfico são atribuídos ao botanista russo Mikkhail Semenovich TSWETT, que em 1906 utilizou estes termos em dois trabalhos descrevendo a separação dos componentes de extratos de folhas e gema de ovo, onde usou colunas de vidro recheadas com vários sólidos finamente divididos, e arrastou os componentes com éter de petróleo. Os componentes apareciam como bandas coloridas na coluna de separação, daí o nome originário das palavras gregas chroma=cor, e graphein=escrever, embora o processo não dependa da cor, exceto para visualizar os componentes separados. HISTÓRICO – época moderna A época moderna da cromatografia foi iniciada na década de 30. KUHN e LEDERER redescobriam e aperfeiçoavam a cromatografia de coluna, repetindo as experiências de Tswett, separando e identificando as xantofilas da gema do ovo, usando uma coluna recheada com carbonato de cálcio pulverizado e éter de petróleo como fase móvel. HISTÓRICO – década de 1940 1941: MARTIN e SYNGE (prêmio Nobel de 1952) descreveram a cromatografia por partição (cromatografia líquido/líquido), aplicaram o conceito de altura equivalente a um prato teórico à cromatografia, e anteciparam o surgimento de duas cromatografias: a gasosa, e a de alta eficiência. MARTIN, CONSDEN e GORDON: reintroduziram a cromatografia de papel; MARTIN e HOWARD: desenvolveram a cromatografia líquida de fase reversa; MARTIN e JAMES: atualizaram a cromatografia gás/líquido. Outros eventos importantes: 1938: IZMAÏLOV e SCHRAÏBER reintroduziram a cromatografia de camada delgada para a análise de produtos farmacêuticos, mas não foi usada até o desenvolvimento, por KIRCHNER e col., do método de de aderir o sólido ao suporte, e por STAHL, do método de preparar as placas com reprodutibilidade. 5 CROMATOGRAFIA PLANAR dR1 dR2 dR3 linha de partida da fase móvel linha de chegada da fase móvel dm profundidade da fase móvel CROMATOGRAFIA EM COLUNA DETECTOR COLUNA RECHEADA SI N A L TEMPO MODO DE DESENVOLVIMENTO FRONTAL DESLOCAMENTO ELUIÇÃO TEMPO A A B A B C A B C D E A B C D E F G H I amostra é continuamente aplicada à coluna; torna-se saturada em relação a um dado componente, que é então eluído, inicialmente na forma pura, depois em mistura preparativa; aplicação única fase móvel tem maior afinidade pela coluna e desloca componente da amostra de menor afinidade; cada componente funciona como deslocador do seguinte analítica; aplicação única 6 OUTRAS CLASSIFICAÇÕES CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM COLUNA: CLÁSSICA: colunas de vidro, sob pressão atmosférica, vazão da fase móvel por ação da gravidade ALTA EFICIÊNCIA: colunas metálicas, ou capilares, sob pressões elevadas POLARIDADE RELATIVA DAS FASES: FASE NORMAL: fase estacionária polar, fase móvel apolar FASE REVERSA: (inverso) fase estacionária apolar, fase móvel polar MECANISMOS DE SEPARAÇÃO físicos fase fase móvel estacionária fase fase móvel estacionária ADSORÇÃO PARTIÇÃO MECANISMOS DE SEPARAÇÃO químicos fase fase móvel estacionária fase fase móvel estacionária TROCA IÔNICA BIOAFINIDADE fase fase móvel estacionária + + + + 7 MECANISMOS DE SEPARAÇÃO mecânicos fase fase móvel estacionária EXCLUSÃO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO, K Amóvel Aestacionária CS K = CM CS CM isoterma de distribuição cromatografia linear RELAÇÃO ENTRE TEMPO DE RETENÇÃO E COEFICIENTE DE PARTIÇÃO L v = tR L u = t0 velocidade linear média do soluto velocidade linear média da fase móvel v = u x fração de tempo do soluto na fase móvel moles do soluto na fase móvel v = u x número total de moles CM VM 1 v = u = u CM VM + CS VS 1 + CS VS / CM VM 1 v = u 1 + K VS/VM 10 EQUAÇÃO DE van DEEMTER 0,0060 0,0040 0,0020 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 H , cm u, cm/s B/u = (2 γ DM) / u A = 2 λ dP fS(k) df2 fM(k) dP2 C u = + u DS DM H = A + B/u + (CS + CM) u λ, γ: constantes que dependem da qualidade do recheio DS, DM: coeficientes de difusão do soluto na fase estacionária e móvel, respectivamente dp, df: diâmetro da partícula e espessura do filme que recobre o suporte da fase estacionária EQUAÇÃO de van DEEMTER – o termo A (caminhos múltiplos) •múltiplos caminhos que a molécula encontra durante seu percurso na coluna •comprimento dos percursos podem diferir consideravelmente; assim o tempo de residência da molécula na coluna também varia A = 2 λ dP •esse efeito, por vezes chamado de difusão por turbulência (eddy diffusion) é proporcional ao diâmetro da partícula •parcialmente compensado por difusão radial: moléculas são transferidas de um percurso para o outro •se vazão da fase móvel é baixa, ocorrerá um grande número de transferências: velocidade de cada molécula se aproxima de um valor médio (contribuição do termo é desprezível) •se vazão é moderadamente alta, não há tempo para as transferências de percurso ocorrer, resultando no alargamento da banda EQUAÇÃO de van DEEMTER – o termo B (difusão longitudinal) •soluto difunde do centro concentrado da banda para regiões mais diluídas, na direção do fluxo B/u = (2 γ DM) / u •o termo B/u é proporcional ao coeficiente de difusão do soluto na fase móvel, DM, e ao fator de obstrução, γ(difusão longitudinal é restringida pelo recheio: colunas recheadas, γ =0,6; colunas capilares não-recheadas, γ =1. •contribuição da difusão longitudinal é inversamente proporcional à velocidade da fase móvel: com o aumento de u, soluto permanece na coluna por períodos mais curtos (difusão tem menos tempo para ocorrer. 11 EQUAÇÃO de van DEEMTER – o termo C (coeficientes de transferência de massa) •equilíbrio de distribuição do soluto entre a fase móvel e estacionária é estabelecido tão lentamente que a coluna praticamente opera num regime de não-equilíbrio •moléculas na frente da banda são empurradas pela fase móvel sem que haja tempo para o equilíbrio se estabelecer •analogamente, o equilíbrio não é estabelecido na parte posterior da banda: moléculas são deixadas para trás, na fase estacionária com o movimento rápido da fase móvel •alargamento devido a efeitos de transferência de massa ocorrem porque os vários caminhos que a fase móvel percorre dentro da coluna ou a camada de líquido imobilizada na fase estacionária, tem dimensões finitas; assim, é necessário um certo tempo para que o soluto possa difundir do interior dessas fases para a interface, onde a transferência ocorre; este tempo de atraso faz com que a situação de não-equilíbrio persista EQUAÇÃO de van DEEMTER – o termo C (coeficientes de transferência de massa) •a extensão do alargamento de banda devido à difusão longitudinal e resistência à transferência de massa depende da velocidade de difusão do soluto •no entanto, a difusão longitudinal ocorre devido à tendência das moléculas em mover na direção paralela ao fluxo enquanto que na transferência de massa, o movimento é perpendicular ao fluxo •assim, a contribuição da difusão longitudinal ao alargamento de banda é inversamente proporcional à velocidade da fase móvel •por outro lado, nos processos de transferência de massa, quanto mais rápida for a velocidade da fase móvel, menos tempo existe para que o equilíbrio seja alcançado; portanto a contribuição dos processos de transferência de massa ao alargamento de banda é proporcional à velocidade da fase móvel EQUAÇÃO de van DEEMTER – o termo CS (transferência de massa na fase estacionária) •quando a fase estacionária é um líquido, o coeficiente de transferência de massa depende da espessura do filme e é inversamente proporcional ao coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária CS u = (fS(k) df2 / DS) u •em ambos os casos, a freqüência com que as moléculas do soluto alcançam a interface é diminuída: em filmes espessos, as moléculas precisam percorrer longas distâncias para atingir a interface; se DS é pequeno, as moléculas migram lentamente •a conseqüência é a baixa velocidade de transferência de massa causando alargamento da banda 12 EQUAÇÃO de van DEEMTER – o termo CM (transferência de massa na fase móvel) •coeficiente de transferência de massa na fase móvel depende do diâmetro da partícula e varia inversamente com o coeficiente de difusão do soluto na fase móvel CM u = (fS(k) dP2 / DM) u •diferenças de percurso são minimizadas se partículas são de diâmetro pequeno •se o soluto difunde rapidamente de um percurso para outro, alargamento é diminuído poços estagnados ALARGAMENTO DE BANDA EXTRA-COLUNA •alargamento ocorre conforme soluto é carregado através de tubos abertos como os do sistema de injeção, da região do detector, da tubulação de conexão dos vários componentes do sistema cromatográfico •decorre do perfil de velocidade radial parabólico (fluxo induzido por pressão): velocidade no centro da banda é maior que nas paredes do tubo •alargamento pode-se tornar sério se colunas capilares são usadas π r2 u Hex = 24 DM RESOLUÇÃO wb1 (t2 – t1) Rs = 2 wb1 + wb2 wb2 t1 t2 (t2 – t1) = 1,18 wh1 + wh2 definição: Outras formas de estimar Rs quando abundância relativa dos solutos difere: •Comparação com curvas de resolução •Cálculo baseado na altura do vale entre os 2 picos 15 CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL •Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como água e trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou éter isopropílico, eram usados como fase móvel; por razões históricas, este tipo de cromatografia é chamado de fase normal •Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluição Polaridade do soluto: a > b > c c b a tempo c b a tempo Po la ri da de d a fa se m óv el CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA •Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18) e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc) •Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição Polaridade do soluto: a > b > c a b c tempo a b c tempo Po la ri da de d a fa se m óv el EFEITO DO COMPRIMENTO DA CADEIA •Cadeias mais longas produzem recheios mais retentivos. 16 CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA •cromatografia por troca iônica (IC, ion exchange chromatography) ou cromatografia de íons: métodos de separação e determinação de íons com base em resinas de troca iônica •desenvolvida durante o projeto Manhattan para a separação de cátions de terras raras com propriedades semelhantes, com resinas trocadoras de cátions; esse trabalho forneceu a base teórica das separações por troca iônica e, após a Segunda Guerra, foi estendido a outros tipos de materiais; detecção era feita por medidas de condutividade; hoje em dia outros detectores são possíveis •falta de um detector sensível para as espécies iônicas eluídas retardou o desenvolvimento da técnica moderna; em 1975, Dow Chemical Company, introduziu o conceito de supressão do eluente, tornando possível a detecção condutométrica em linha CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA PRINCÍPIO: equilíbrios de troca entre íons em solução e íons de mesmo sinal na superfície de um sólido (resina ou polímero de alta massa molecular e insolúvel) •trocadores de íons naturais: argila e zeólitas foram usados por décadas •trocadores sintéticos: produzidos em 1930, para “amolecer a água”, nos processos de desionização da água e purificação de soluções •sítios ativos mais comuns nos trocadores de cátions: grupo ácido sulfônico -SO3-H+ (ácido forte) e grupo ácido carboxílico – COO-H+ (ácido fraco) •sítios ativos mais comuns nos trocadores de ânions: grupos amina terciária –N(CH3)3+OH- (base forte) e grupos amina primária –NH3+OH- (base fraca) CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA Quando um trocador iônico de ácido sulfônico é colocado em contato com uma solução aquosa contendo o cátion C, o equilíbrio de troca estabelecido é o seguinte: x RSO3-H+ + Cx+
(RSO3-)xCx+ + x H+ sólido solução sólido solução analogamente, um trocador de ânions interage com o ânion A segundo a reação: y RN(CH3)3+OH- + Ay-
(RN(CH3)3+)yAy- + y OH- sólido solução sólido solução 17 MECANISMO DE TROCA X+ Z+ W+ X+ X+X+ X+B+ C2+ B+ C2+ C2+ C2+ C2+ B+ X+ X+ X+ X+ X+ X+ Z+ Z+ B+ B+ W+ W+ W+ Z+ B+ B+ C2+C2+ C2+ X+ X+ X+ X+ W+ W+ W+ W+ Z+ B e C: analitos X, Z e W: são íons contidos nos eluentes a b c d e MECANISMO DE TROCA X+ X+ X+X+ B+ C2+ B+ C2+ C2+ B+ X+ X+ X+ X+ X+ X+a b •(a): trocador catiônico está em equilíbrio com o eluente inicial X+; B+ e C2+ são materiais a serem separados •(b): quando determinada quantidade da amostra é introduzida na coluna, ocorre uma reação de troca liberando quantidade equivalente de X+, anteriormente ligado à matriz MECANISMO DE TROCA Z+ B+ C2+ C2+ C2+ C2+ B+ Z+ Z+ B+ B+ B+ B+ b´ c •(b´): após a adsorção do analito na resina, é aplicado um eluente que contém íons Z+, com uma afinidade um pouco maior pelos grupos trocadores da resina •(c): os íons Z+ irão provocar a liberação da substânca B+, ligada mais fracamente à resina que a substância C2+ 20 Considere a reação de troca do cation B+ na resina sulfônica: •a eluição da resina com solução ácida diluída desloca o equilíbrio para a esquerda, fazendo com que parte dos íons B+ na fase estacionária seja transferida para a fase móvel; esses íons movem- se coluna baixo numa série de transferências sucessivas entre fase estacionária e móvel O equilíbrio é governado pela constante: SELETIVIDADE RSO3-H+ (s) + B+ (aq)
RSO3-B+ (s) + H+ (aq) [RSO3-B+]s . [H+]aq Ktr = [RSO3-H+]s . [B+]aq Rearranjando temos: •durante a eluição, a concentração de H+ é muito maior que a concentração de B+ na fase móvel •além disso, o trocador tem um número apreciável de sítios disponíveis para troca de B+ Assim, quando [H+]aq >> [B+]aq e [RSO3-H+]s >> [RSO3-B+]s o lado direito da equação acima é constante SELETIVIDADE [RSO3-B+]s [RSO3-H+]s = Ktr [B+]aq [H+]aq [RSO3-B+]s CS = K = [B+]aq CM constante de distribuição •para H+ como íon de referência têm-se: íons polivalentes são mais fortemente retidos que espécies monocarregadas; para grupos de íons de mesma carga, diferenças de retenção aparecem devido ao grau de hidratação e outras propriedades •o trocador iônico prefere: íons que têm alta carga, seguido de íons que têm pequeno tamanho (solvatado), íons altamente polarizáveis e por fim íons que têm interações fracas com a fase móvel CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA •Ktr representa a afinidade da resina pelo íon B+ em relação ao íons H+ •quando Ktr é grande significa que existe uma grande tendência da fase reter B+ RSO3-H+ (s) + B+ (aq)
RSO3-B+ (s) + H+ (aq) [RSO3-B+]s . [H+]aq Ktr = [RSO3-H+]s . [B+]aq 21 CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA •Para uma resina de troca catiônica, os valores de Ktr decrescem na ordem para cátions monovalentes: e cátions divalentes: Tl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+ Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+ •Para uma resina de troca aniônica, os valores de Ktr decrescem na ordem: SO42- > C2O42- > I- > NO3- > Br- > Cl- > HCOO- > CH3COO- > OH- > F- CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA aplicações típicas CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO Resolução é baseada no tamanho efetivo dos componentes da amostra: •limite de permeação: abaixo do qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas dentro dos poros do material •limite de exclusão: acima do qual todas as moléculas são muito grandes para penetrar os poros •somente podem ser separadas as moléculas que se encontram dentro dos dois limites VOLUME, mL EXCLUSÃO TOTAL PERMEAÇÃO TOTAL M A S SA M O LE CU LA R 106 105 104 103 V0 Vi Vt = V0 + Vi Vt volume total da fase móvel Vo volume intersticial (entre as partículas, fora dos poros) Vi volume intrasticial (dentro dos poros) 22 CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO • Relação de retenção em CE Vt = Vg + Vi + V0 Vt: volume total da coluna Vg: volume da matriz sólida Vi : vol. intersticial V0: vol. morto • Eluição Ve = V0 + Kvi 0 < K < 1 INSTRUMENTAÇÃO EM SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS EM FASE LÍQUIDA 13. Instrumentação 13.a. Reservatórios para fase móvel 13.b. Sistemas de bombeamento 13.c. Injetores 13.d. Características da fase móvel 13.e. Colunas e recheios por técnica INSTRUMENTAÇÃO Figura 28-4 Skoog instrumental p644 versão português 25 INSTRUMENTAÇÃO – sistema de injeção de amostras •fator limitante da precisão: repetibilidade da injeção •volumes devem ser pequenos (evitar alargamento de banda e sobrecarga da coluna, “overload”): < 500 µL •conveniente injetar amostra sem despressurizar o sistema •sistema mais comum: alça de injeção (loop) mediante seringa; escolha de 0,5 a 500 µL; permite injeção a pressões de até 7000 psi; precisão melhor que 1% INSTRUMENTAÇÃO – colunas •em geral, tubos de aço inoxidável, mas tubos de vidro com paredes resistentes também são encontrados (restritos a pressões mais baixas, 600 psi) •diversidade de colunas recheadas são disponíveis comercialmente, com preços variando entre US$ 200 a 500 INSTRUMENTAÇÃO – colunas •Colunas analíticas: em geral de 10 a 30 cm; 4 a 10 mm diâmetro com partículas de 3, 5 e 10 µm (60000 pratos/m) •Pré-coluna: introduzida antes da coluna de separação para aumentar a vida útil desta remove material particulado e contaminantes provenientes do solvente serve para saturar a fase móvel com fase estacionária minimizando a sangria da coluna composição deve ser similar a da coluna analítica, com tamanho de partícula em geral maior (minimizar queda de pressão) •Termostatização: em geral coluna é operada a temperatura ambiente; no entanto, cromatogramas de melhor qualidade são obtidos quando a temperatura da coluna é controlada; fornos aquecidos até 100-150 °C estão disponíveis 26 CARACTERÍSTICAS DAS FASES MÓVEIS •alto grau de pureza ou de fácil purificação (permitir alta sensibilidade nos detectores de absorvância ou fluorescência) •dissolver a amostra sem decompor os seus componentes (se possível, solvente da amostra é a própria fase móvel) •não decompor ou dissolver a fase estacionária (uso da pré-coluna para saturação da fase móvel com fase estacionária; fase ligada ou sólida dispensam esse procedimento) •ter baixa viscosidade (favorecer transferência de massa) •ser compatível com o tipo de detector utilizado (particularmente importante na eluição por gradiente) •ter polaridade adequada para permitir separação conveniente dos componentes da amostra PROPRIEDADES DAS FASES MÓVEIS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA SOLVENTE ÍNDICE DE VISCOSIDADE PONTO DE ÍNDICE DE FORÇA DO REFRAÇÃO cP EBULIÇÃO °C POLARIDADE ELUENTE* n-Hexano CCL4 Éter dietílico THF Clorofórmio Etanol Acetato de etila MeOH ACN Etileno glicol Água 1,.372 1,457 1,350 1,405 1,433 1,359 1,370 1,326 1,341 1,431 1,333 0,30 0,46 0,54 0,34 0,89 81 66 65 82 100 0,04 4,0 5,1 5,8 10,2 -0,2 0,57 0,95 0,65 grande *sobre Al2O3 CARACTERÍSTICAS DAS FASES ESTACIONÁRIAS alumina, celulose, sílica gel e zeolita: cromatografia líquida clássica TIPOS DE RECHEIO •sólidos rígidos (sílica), semi-rígidos (partículas porosas de poliestireno entrecruzado) ou não rígidos (agarose ou dextrose) •partículas porosas ou peliculares •partículas esféricas ou irregulares •partículas com diferentes diâmetros partículas porosas partículas peliculares partículas microporosas 27 SÓLIDOS E SUPORTES para cromatografia líquido-sólido (CLS), cromatografia líquido-líquido (CLL) e com fase ligada (CLFL) SÓLIDOS PARA CLS •partículas totalmente porosas de 5-10 µm ou materiais maiores (30-40 µm) com película porosa •quase todas as separações são limitadas a alguns tipos de adsorventes: sílica ou alumina •componentes mais polares da amostra são retidos preferencialmente: •ordem usual de eluição: hidrocarbonetos saturados < olefinas < hidrocarbonetos aromáticos ≈ haletos orgânicos < sulfetos < éteres < ésteres ≈ aldeídos ≈ cetonas < álcoois ≈ aminas < amidas < ácidos carboxílicos SUPORTES PARA CLL •preferência para materiais inertes; no entanto como não existem materias inertes com rigidez e uniformidade necessárias, usa-se sílica, por vezes desativada, porosa ou superficialmente porosa SÓLIDOS E SUPORTES para cromatografia líquido-sólido (CLS), cromatografia líquido-líquido (CLL) e com fase ligada (CLFL) EXEMPLOS sólidos microporosos: •sílica esférica: série LICHROSPHERE-Si (E-Merck); diâmetro de partícula (3, 5 e 10 µm ) ; tamanho de poro (6, 10 e 30 nm); volume de poro (1,1-1,4 mL/g); área da superfície (60-400 m2/g) •sílica irregular •alumina esférica •alumina irregular: ALOX 60D (Macherey-Nagel); diâmetro de partícula (5 e 10 µm ) ; tamanho de poro (6 nm); área da superfície (60 m2/g) •carbono grafitizado •polímeros de estireno divinilbenzeno; polímeros de vinilpiridina e polímeros de propilamida-6 Tabela IX-5 Collins, p199 SÓLIDOS E SUPORTES para cromatografia líquido-sólido (CLS), cromatografia líquido-líquido (CLL) e com fase ligada (CLFL) EXEMPLOS sólidos peliculares: •sílica ativa: CORASIL I (Waters); diâmetro de partícula (37-50 µm); área da superfície (7 m2/g) •sílica inativa (somente usado como suporte): ZIPAK (DuPont); diâmetro de partícula (26-37 µm); área da superfície (1 m2/g) •alumina: PELLUMINA HS (Whatman); diâmetro de partícula (37-44 µm); área de superfície (8 m2/g) Tabela IX-6 Collins, p200 30 FASES ESTACIONÁRIAS cromatografia por exclusão Materiais para cromatografia por exclusão variam de acordo com a rigidez e intervalo de tamanho das moléculas a ser separadas: •materiais fracos (não rígido): géis de polidextrano (Sephadex), poliacrilamidas (Bio-Gel P) e poliagaroses (Sepharose e Bio-Gel A); usados com fase móvel aquosa; cromatografia de coluna clássica •materiais semi-rígidos (resistem a pressões de 100 a 150 bar): microesferas de copolímero como poliestireno-divinilbenzeno; usados com fases aquosas e orgânicas; também para cromatografia clássica •materiais rígidos: partículas de sílica porosa ou de vidro poroso (desativados) FASES ESTACIONÁRIAS cromatografia por exclusão Estrutura parcial da Sephadex Figura VI-4 Collins p106 Estrutura parcial da agarose Figura VI-5 Collins p107 Estrutura parcial da Sepharose com ligações entrecruzadas Figura VI-6 Collins p108 Estrutura parcial de Sephacryl Figura VI-7 Collins p109 FASES ESTACIONÁRIAS cromatografia por exclusão EXEMPLOS fases microporosas: •BIOGEL SEC (BioRad); material (estireno-divinilbenzeno); diâmetro da partícula (10 µm); faixa de massa molecular (103 – 8x106) •µ-BONDAGEL (Waters); material (sílica); diâmetro da partícula (10 µm); faixa de massa molecular (2x103 – 7x106) •OHPAK-Q (Showa Denko); material (polivinil álcool); faixa de massa molecular (500 - 5000) Tabela IX-10 Collins, p206 31 13.f. Detectores 13.f.1. Detectores de absorvância no UV-vis 13.f.2. Detectores de absorbância no Infravermelho 13.f.3. Detectores de fluorescência 13.f.4. Detectores Refratométricos 13.f.5. Outros: eletroquímicos, espalhamento, radioatividade 13.f.6. Detectores por Espectrometria de Massas DETECTORES ÓPTICOS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA DETECTORES •monitoramento do efluente que sai da coluna ESTRATÉGIAS: •medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas, amostras e fase móvel •medidas de uma propriedade da amostra que não é apresentada pela fase móvel •detecção após eliminação da fase móvel DETECTOR IDEAL •alta sensibilidade e baixo limite de detecção •resposta rápida a todos os solutos •insensibilidade a mudanças de temperatura e na vazão da fase móvel •resposta independente da fase móvel •pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector •resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto •não destruição do soluto •segurança e conveniência para uso •informação qualitativa do pico desejado 32 DETECTORES 2 TIPOS: SELETIVO versus UNIVERSAL UNIVERSAL: responde às propriedades da fase móvel (índice de refração, constante dielétrica ou densidades, moduladas pela presença do soluto) SELETIVO: responde às propriedades do soluto (absorvância no UV-vis, fluorescÊncia, corrente de difusão) que a fase móvel não possui PARÂMETROS FUNDAMENTAIS •sensibilidade: relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal (termo relativo, depende da amostra) •linearidade: faixa linear do sistema onde o sinal do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto; se concentração da amostra é muito alta (diluições apropriadas) •limite mínimo de detecção: menor quantidade da substância que pode ser detectada, produzindo um sinal igual ao dobro do nível de ruído do instrumento; ruído é a variação do sinal do instrumento que não é atribuída à amostra e pode ser produzida por falhas eletrônicas, aparelhos mal aterrados, variações de vazão ou temperatura, flutuações na tensão, bolhas de ar no detector, etc. •variações na composição da fase móvel podem produzir grandes flutuações na linha de base, principalmente nos casos de eluição por gradiente NÚMERO DE TRABALHOS PUBLICADOS EM LC até 1982: 365 trabalhos publicados •71%: UV-vis •15%: fluorescência •5,4%: índice de refração •4,3%: eletroquímico •4,3%: outros UV-vis: 39%: baseados em linhas de emissão do Hg) 13%: radiação filtrada de uma fonte de deutério 48%: radiação emitida de um monocromador de rede 35 ESQUEMA DE UM DETECTOR DE ABSORBÂNCIA NO UV-VIS COM COMPRIMENTO DE ONDA VARIÁVEL DETECTORES DE ABSORBÂNCIA arranjo de diodos •alto custo • relativamente complexo •toda a luz da fonte passa pela cela da amostra •a luz emergente é dispersada por uma grade holográfica (rede de difração •a radiação dispersada resultante (comprimentos de onda distintos) é focalizada sobre uma fila de fotodiodos (256-512nm) •todo o espectro da substância passando pelo detector é armazenado no microcomputador DETECTORES DE ABSORBÂNCIA arranjo de diodos •é possível exibir um cromatograma para cada comprimento de onda selecionado •é possível exibir o espectro em cada tempo determinado, ou seja, o espectro do pico cromatográfico 36 DETECTORES DE ABSORBÂNCIA no infra-vermelho •a absorbância na região do infra-vermelho pode ser usada como detector universal ou específico •sensibilidade é em geral muito pequena •usados principalmente em sistemas de cromatografia por exclusão •técnica de parar a vazão da fase móvel com a amostra na cela e tirar o espectro infravermelho •limitado a fases móveis transparentes no comprimento de onda utilizado DETECTORES DE FLUORESCÊNCIA •detecção específica para compostos que fluorescem e uma das mais sensíveis técnicas de detecção (picogramas, 10-12g); comparável ao detector por captura de elétrons em GC •alta intensidade de fluorescência é esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que não podem produzir estruturas fortemente iônicas •reações de derivação pós-coluna (esteróides podem produzir fluorescência quando aquecidos com ácido sulfúrico) •aplicações: área farmacêutica, alimentos, caracterização de destilados do petróleo de alto p.e. •fase móvel deve ser criteriosamente selecionada (intensidade de emissão depende do meio; efeito quencher) ESQUEMA DE UM DETECTOR POR FLUORESCÊNCIA •filtro secundário é escolhido para eliminar o comprimento de onda excitante, e deixar passar o comprimento de onda emitido pela amostra •filtro primário é escolhido para deixar passar somente o comprimento de onda de excitação 37 DETECTORES POR ÍNDICE DE REFRAÇÃO •acompanha continuamente a diferença de no índice de refração entre a fase móvel e o efluente que sai da coluna •resposta universal e sensibilidade moderada (micrograma, 10-6g) •controle rigoroso de temperatura (0,001 °C): circulação de água de uma fonte termostatizada através do refratômetro ou controle da temperatura ambiente •sensível a variações de vazão e mudanças na composição da fase móvel (dificulta/impede seu uso na eluição por gradiente); difícil encontrar um par de solventes com índices de refração idênticos •não são instrumentos muito estáveis, nem de fácil manipulação •emprego mais importante: em cromatografia por exclusão (polímeros, amostras de interesse biológico) e em cromatografia preparativa ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMÉTRICO tipo Fresnel •na interface entre um prisma de vidro e um líquido, a quantidade de luz transmitida e refletida é proporcional ao ângulo de incidência da luz e ao índice de refração do líquido •a luz da fonte atravessa um seletor, um filtro de infravermelho, outro seletor e uma lente •os seletores e a lente produzem dois raios colimados que entram no prisma e incidem sobre a interface vidro-líquido das celas de referência e amostra •o ajuste grosso e fino do ângulo de incidência nas interfaces é realizado através da rotação do corpo do projetor ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMÉTRICO tipo Fresnel •a diferença de intensidade da luz transmitida através das celas é função do Ind. Refr. de ambos os líquidos e se determina por meio de um foto- detector duplo, o qual gera um sinal elétrico, transmitido para o registrador •desvantagem: para cobrir a faixa de Ind. Refr. normal (η = 1,31 a 1,63), são necessários dois prismas •as celas são cavidades ovaladas de teflon (3 µL) presas entre o prisma e a uma placa de aço inoxidável que contém os tubos de entrada e saída 40 MÉTODOS TÍPICOS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS GASOSAS •CAPTURA EM FASE SÓLIDA: amostra gasosa passa através de um tubo contendo sorvente (sílica gel, carvão ativo); os analitos são capturados e eluídos posteriormente com um solvente forte; vazão deve ser controlada para evitar formação de aerossóis, sobrecarga e adsorção irreversível do analito; complexantes podem ser adicionados para melhorar eficiência da captura (purge and trap technique) •CAPTURA EM LÍQUIDO: amostra gasosa é passada por uma solução que captura os analitos; vazão de gás deve ser baixa o suficiente para não criar espumas ou aerossóis; complexante pode ser adicionado ao solvente para auxiliar captura;temperatura pode ser baixada para espécies voláteis princípios e comentários MÉTODOS TÍPICOS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS LÍQUIDAS •EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA: amostra líquida passa através de uma fase sólida que remove seletivamente o analito; analito é então eluído com solvente forte; em alguns casos os interferentes são retidos; várias fases disponíveis comercialmente para uma ampla faixa de aplicações (análise de traços) •EXTRAÇÃO ÍQUIDO-LÍQUIDO: amostra é distribuída entre 2 fases imiscíveis, escolhidas para apresentarem a mior diferença possível de solubilidade; formação de emulsões é possível (quebrar com aquecimento, adição de sal); o coeficiente de distribuição, KD, é alterado pelo tipo de solvente e aditivos (tampões para ajuste de pH, sais para ajuste de força iônica, agentes complexantes, reagentes para pareamento iônico); recomenda-se extração contínua para KD pequenos ou grandes volumes princípios e comentários MÉTODOS TÍPICOS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS LÍQUIDAS •DILUIÇÃO: amostra é diluída com solvente apropriado para a fase móvel escolhida; para evitar sobrecarga (overload) ou para estar dentro da faixa linear de resposta do detector; para evitar alargamento de banda, solvente da amostra não seve ser muito forte comparado com a fase móvel; “dilute and shoot” •EVAPORAÇÃO: líquido é removido por aquecimento brando a pressão ambiente sob fluxo de ar ou gás inerte ou sob vácuo; perdas de amostras podem ocorrer por evaporação rápida, adsorção nas paredes do frasco; uos de gases inertes é aconselhável; evaporador rotatório; sistemas automatizados (Turbovap) •DESTILAÇÃO: amostra é aquecida ao ponto de ebulição do solvente e analitos voláteis são concentrados na fase de vapor, condensados e coletados; uso limitado para amostras facilmente volatilizadas; amostra pode decompor se aquecida em demasia; destilação a vácuo, por arraste de vapor são recomendadas 41 MÉTODOS TÍPICOS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS LÍQUIDAS •MICRODIÁLISE: membrana semipermeável é colocada entre 2 fases aquosas líquidas e os solutos são transferidos de um líquido para outro de acordo com suas concentrações diferenciais; técnicas de enriquecimento, como SPE, são por vezes requeridas para concentração dializatos; microdiálise é usada para exame de fluidos extracelulares em tecidos de plantas e animais, em estudos de fermentação; já foi usada on-line com micro-LC; diálise com membranas específicas para certas massas moleculares são amplamente usadas para desproteinizar amostras antes da injeção cromatográfica; ultrafiltração e osmose reversa são usadas de forma semelhante •LIOFILIZAÇÃO: amostra aquosa é congelada e a água é removida por sublimação sob vácuo; excelente para compostos não voláteis; grandes quantidades de amostra podem ser manipuladas; possível perda de componentes voláteis; sais inorgânicos são concentrados no processo MÉTODOS TÍPICOS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA SUSPENSÕES •FILTRAÇÃO: amostra é passada através de filtros de papel ou membrana para remover partículas em suspensão; altamente recomendado para prevenir problemas com pressão de retorno e para preservar a vida da coluna; filtros de membrana devem ser compatíveis com o solvente para evitar sua dissolução durante o tratamento da amostra; uso de filtros de alta porosidade (>2 µm) é recomendado para vazões altas e filtros de posidade baixa (<0,2 µm) são usados para remover batérias •CENTRIFUGAÇÃO: amostra é colocada no tubo da centrífuga fechado e submetida a alta rotação para decantação; remoção dos sólidos do fundo do tubo pode apresentar problemas práticos; ideal quando o sobrenadante contém o analito de interesse princípios e comentários MÉTODOS TÍPICOS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA SUSPENSÕES •SEDIMENTAÇÃO: amostra é levada à sedimentação em um tanque, permanecendo alí por um tempo longo; velocidade de decantação depende do raio de Stokes; processo extremamente lento; recuperação manual de partículas de diferentes tamanhos pode ser obtida em tempo determinados, que dependem da velocidade de sedimentação 42 MÉTODOS TRADICIONAIS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SÓLIDAS •EXTRAÇÃO LÍQUIDO-SÓLIDO: amostra é colocada em um frasco fechado e solvente é adicionado para dissolver o analito de interesse; solução é separada do sólido por filtração (“shaker/filter” method); solvente é algumas vezes aquecido ou usado sob refluxo para aumentar a solubilidade; amostra deve ser finamente dividida; amostra pode ser agitada manualmente ou automaticamente; amostra é filtrada, decantada ou centrifugada para separar sólidos insolúveis •EXTRAÇÃO EM SOXHLET: amostra é colocada em um reservatório poroso descartável (thimble (dedal) ou papel); refluxo constante de solvente passa pelo dedal e dissolve os analitos de interesse que são coletados continuamente em um frasco de destilação; extração ocorre em solvente puro; amostra deve ser estável no p.e. do solvente; lento, mas o processo não necessita supervisão (extração exaustiva); barato; recuperações excelentes; em geral usado como método de referência princípios e comentários MÉTODOS TRADICIONAIS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SÓLIDAS •FORCED-FLOW LEACHING: amostra é colocada em um tubo pelo qual é forçada a passagem de solvente; tubo é aquecido a temperaturas próximas à ebulição do solvente; adequado para amostras particuladas; solvente deve ser bombeado ou forçado através da amostra com o auxílio de pressão externa (nitrogênio); requer um volume menor que o Soxhlet, com recuperações semelhantes e mais rápida •HOMOGENEIZAÇÃO: amostra é colocada em um liquidificador (blender) juntamente com solvente; amostra é dividida em finamente durante processo; solvente é filtrado para tratamento posterior; usado para tecidos de plantas e animais, na análise de alimentos e amostras ambientais; solventes orgânicos ou inorgânicos podem ser usados; gelo seco ou terra diatomáceas podem ser adicionados MÉTODOS TRADICIONAIS DE PRÉ-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SÓLIDAS •SONICAÇÃO: amostra finamente dividida é dispersa em solvente e submetida à radiação em um banho de ultra-som; dissolução é promovida pelo processo de ultra-som; banho pode ser aquecido; seguro; rápido; melhor para partículas grossas ou materiais granulares; contato eficiente da amsotra e solvente •DISSOLUÇÃO: amostra é tratada com solvente extrator e levada diretamente à solução com ou sem reação química; sólidos inorgânicos requerem soluções ácidas ou básicas para dissolução completa; amostras orgâncias podem ser dissolvidas diretamente em solvente; filtração pode ser indicada após dissolução 45 SPE – SELEÇÃO DE FASES E SOLVENTE AMOSTRA MM<2000 INSOLÚVEL EM ÁGUA POLAR MODERADAMENTE POLAR APOLAR n-BPC -CN; diol; 1,2- diamino C6; CHCl3; CH2Cl2; acetona LSC SiO2; florisil; alumina C6; CHCl3; CH2Cl2; EtOAc; MeOH; IPA RPC C18; C8; ciclohexil; fenil; C2; C4; -CN C6; CH2Cl2; acetona; ACN; MeOH; H2O ESCOLHA DA TÉCNICA CROMATOGRÁFICA EM FUNÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA AMOSTRA < 2000 > 2000 MASSA MOLECULAR ALTA MASSA MOLECULAR INSOLÚVEL EM ÁGUA > 2000 MASSA PROPRIEDADES MOLECULAR SOLÚVEL EM ÁGUA NÃO- IÔNICO IÔNICO BÁSICO ÁCIDO 46 > 2000 SOLÚVEL EM ÁGUA NÃO- IÔNICO IÔNICO BÁSICO ÁCIDO MODALIDADE FASE ESTACIONÁRIA típica FASE MÓVEL típica INSOLÚVEL EM ÁGUA CE gel de poliestireno THF CHCl3 gel de dextrano H2O MeOHCE SP: sulfopropil CE: cromatografia por exclusão DEAE: dietilaminoetil CTI: cromatografia por troca iônica CTI CTI SP- dextrano tampão aquoso tampão aquoso DEAE- dextrano INSOLÚVEL EM ÁGUA < 2000 MASSA PROPRIEDADES MOLECULAR SOLÚVEL EM ÁGUA NÃO- IÔNICO IÔNICO BASE FRACA ÁCIDO FRACO ÁCIDO FORTE BASE FORTE SOLÚVEL EM HEXANO SOLÚVEL EM METANOL POLAR MODERADA- MENTE POLAR NÃO POLAR BAIXA MASSA MOLECULAR INSOLÚVEL EM ÁGUA < 2000 SOLÚVEL EM HEXANO SOLÚVEL EM METANOL POLAR moderada mente POLAR NÃO POLAR MODALIDADE FASE ESTACIONÁRIA típica FASE MÓVEL típica C18 MeOH/H2OACN/H2O CLFL/FR sílica n-C7H16/ CHCl3/C6H5CH3CLS FR: fase reversa FN: fase normal CN-nitrilo silíca*=sílica desativada ACN=acetonitrila MeOH=metanol pr-OH: propanol CLFL: cromatografia em fase ligada CLS: cromatografia líquido-sólido C8 ACN/H2O CLFL/FR sílica n-C7H16/CHCl3CLS CLFL/FN CLS CLFL/FR MeOH/H2O sílica* n-C7H16/CHCl3 CN n-C7H16/ CHCl3/pr-OHC8 47 < 2000 SOLÚVEL EM ÁGUA NÃO- IÔNICO IÔNICO BASE FRACA ÁCIDO FRACO ÁCIDO FORTE BASE FORTE MODALIDADE FASE ESTACIONÁRIA típica FASE MÓVEL típica C18 MeOH/H2O ACN/H2O CLFL/FR FR: fase reversa pi: pareamento iônico MeOH: metanol ACN: acetonitrila AHS: ác. hexanossulfônico TBA: hidróxido de tetrabultilamônio CLFL: cromatografia em fase ligada CTI: cromatografia por troca iônica trocador de cátions tampão aquosoCTI AHS/H2OCLFL/FR-pi CLFL/FR-pi TBA/H2O CTI trocador de ânions tampão aquoso C18 C18 14. Métodos qualitativos 15. Métodos quantitativos 16. Validação P10. DETECTORES ÓPTICOS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA MÉTODOS QUALITATIVOS •Spiking com padrões •Razão de comprimentos de onda (antigas anotações de CE) •Coleta de frações para IR, NMR e MS (MS como detector)